Психотерапевт кодирует пациентов от обжорства!

Психотерапевт Владимир Миркин занимается тем, что «отговаривает» людей есть сладкое, мучное и все то, что может негативно отразиться на фигуре. А делает он это с помощью…кодирования или, другими словами, гипноза! Как действует эта методика похудения и не вредна ли она?

«Я очень долго работал с алкоголиками, окончил курсы по кодированию. Однажды я заметил, что у тех, кто переедает, тот же корень проблемы, что и у алкоголиков – психологический. И я даже не менял метод – стал кодировать от обжорства и эффективно помогать людям, которые никак не могут похудеть. Я даю человеку установку – не есть сладкого и мучного. Далее он садиться на специальную диету и худеет», – рассказал о своей работе психотерапевт.

«Диета очень простая: нельзя есть сладкого, картошку, макароны – углеводы исключаются. Нельзя есть жирного, основная еда – белки. Ну и через день нужно делать разгрузочные дни на одном кефире», – добавил Владимир Миркин.

Читайте также: Как работает техника гипноза?

Однако у диетолога Светланы Фус есть своя точка зрения на предложенную диету. «Я детально изучила «диету». Это ж не диета, а безобразие какое-то! Во-первых, я подсчитала калорийность, она сильно занижена. Плюс – через день разгрузочные дни! Эта диета нацелена на истощение  организма. Не понимаю, зачем так делать,  если можно не изнурять человека, а грамотно просчитать  калории», – отметила специалист.

Читайте также: Как отбивать гипнотические атаки?

Верить в то, что лишние килограммы исчезнут сами по себе или благодаря гипнотизеру – не стоит. Только вы сами являетесь скульптурами своей фигуры, а также хранителями здоровья. Берегите себя!

Больше – в видео:

Video: Психотерапевт кодирует пациентов от обжорства!

Психотерапевт Владимир Миркин занимается тем, что «отговаривает» людей есть сладкое, мучное и все то, что может негативно отразиться на фигуре. А делает он это с помощью…кодирования или, другими словами, гипноза! Как действует эта методика похудения и не вредна ли она?

PHNjcmlwdCBkYXRhLW91dHN0cmVhbS1pZD0iNzg5Ig0KZGF0YS1vdXRzdHJlYW0tZm9ybWF0PSJvdXRzdHJlYW0iIGRhdGEtb3V0c3RyZWFtLXNpdGVfaWQ9IlNUQl9PdXRzdHJlYW0iIGRhdGEtb3V0c3RyZWFtLWNvbnRlbnRfaWQ9Ind3dy5zdGIudWEvemF6aHl2ZSIgc3JjPSIvL3BsYXllci52ZXJ0YW1lZGlhLmNvbS9vdXRzdHJlYW0tdW5pdC8yLjAxL291dHN0cmVhbS11bml0Lm1pbi5qcz9mYj0wMDEiPjwvc2NyaXB0Pg0K

PGRpdiBpZD0nZGl2LWdwdC1hZC0xNDgyNDg1OTg3MTc0LTAnPg0KPHNjcmlwdD4NCmdvb2dsZXRhZy5jbWQucHVzaChmdW5jdGlvbigpIHsgZ29vZ2xldGFnLmRpc3BsYXkoJ2Rpdi1ncHQtYWQtMTQ4MjQ4NTk4NzE3NC0wJyk7IH0pOw0KPC9zY3JpcHQ+DQo8L2Rpdj4=

Лечение пищевой зависимости в Новосибирске

ЛЕЧЕНИЕ ИЗБЫТОЧНОГО ВЕСА В КЛИНИКЕ «ИНСАЙТ»

Авторская программа снижения веса от клиники «ИНСАЙТ»

За 25 ЛЕТ работы специалисты Клиники «ИНСАЙТ» помогли многим обрести стройность и легкость!

В основе современного подхода к избыточному весу лежит признание хронического характера заболевания и, следовательно, необходимости долгосрочного лечения. Можно похудеть на 18 кг за 40 дней, как гласят рекламные плакаты, но этот подход обречен на провал (снижение скорости обмена веществ из-за резкого похудания приведет к компенсаторному увеличению приема пищи и повторной прибавке веса).

Вторым принципом является необходимость сравнительно безопасных методов лечения (не более опасных, чем само заболевание). Третий принцип – профилактическая направленность лечения. Лучше потерять 10 кг и удержать новую массу тела, чем потерять за короткий срок 40 кг и набрать вскорости 50. 

В новосибирской Клинике «ИНСАЙТ» более чем за 20 лет ее существования накоплен большой опыт работы по коррекции веса. Специалисты Клиники «ИНСАЙТ» руководствуются в лечении заболевания всеми вышеизложенными принципами, при этом каждый врач использует собственную методику работы, умело совмещая и комбинируя иглорефлексотерапию, психотерапию, кодирование, коррекцию питания. Это даёт впечатляющие результаты. Снизив с помощью специалистов Клиники массу тела до нормы, более 80 процентов пациентов удерживают оптимальный вес в течение двух и более лет.

 

Поскольку корень проблемы избыточного веса в подавляющем большинстве кроется в особенностях психики человека, лечением ожирения в клинике занимаются врачи-психотерапевты: Трубникова Елена Георгиевна, Кизим Елена Станиславовна, Кучеревская Наталья Яковлевна. Врачи психотерапевты Клиники «ИНСАЙТ» являются авторами уникального метода. Он  называется «метод коннекционного блокирования». 

Об этой разработке, заведующий кафедрой психотерапии РАМН профессор, доктор медицинских наук В. В. Макаров отозвался  следующим образом: «С 1992 года метод коннекционного блокирования доказал свою исключительную эффективность при алиментарном ожирении и является на сегодняшний день единственной психотехнологией, позволяющей производить радикальные изменения основных уровней организма (сознательно-подсознательной сферы, эндокринной и пищеварительной системы, опорно-двигательного аппарата), формируя устойчивый и долговременный результат». 

Игорь Алексеевич Эверест  начинает описание этого метода  замечательными словами: «Ваше тело является полным отражением Вашего стиля жизни (скорости мыслительных процессов, эмоций и глубины ощущений).

Изменять его, не осознав того, как Вы хотите изменить свою жизнь, бессмысленно. Извлеките ошибки из прошлого, наберитесь терпения и, став чуточку мудрее, идите навстречу своему новому «Я». 

Говоря о сути методики, он констатирует: «Метод коннекционного блокирования базируется на том, что алиментарное ожирение – это патологическое состояние организма, характеризующееся хроническим положительным балансом с одновременным снижением процессов основного обмена, вызванное комплексом причин социально-психологического характера с прочной фиксацией механизмов нездорового питания и вторичных выгод в подсознательных установках личности. 

Выздоровление при данном заболевании возможно. Лечение предполагает использование сложной психотехнологии, воздействующей на все основные звенья патогенеза. Такой психотехнологией и является метод коннекционного блокирования. Название его происходит от английского connection – «связь», «соединение» и bloc – «блок», «массив», «файл». Во время психотерапевтических сеансов в процессе лечения в подсознание вводятся блоки фиксированной информации, и декларируемое Вашим сознанием желание похудеть связывается с многочисленными механизмами выздоровления на сознательном и подсознательном уровнях. Результатом процесса является формирование здорового пищевого и двигательного поведения. 

Противопоказанием к применению метода являются психические нарушения, онкологические заболевания, хронические заболевания в стадии обострения, черепно-мозговые травмы, сахарный диабет, беременность. 

В основе методики лежит положение нейролингвистики и нейроэндокринологии о том, что мозг человека способен к внезапным изменениям, которые, находясь под контролем сознания, могут стать длительными (привычными). Конечная цель терапии – помочь Вам лучше контролировать свою жизнь и в меньшей степени чувствовать себя жертвой нездоровых способов поведения.

Являясь глубинной технологией, метод коннекционного блокирования воздействует на несколько уровней функционирования организма:

1. Снижает патологическую активность центра аппетита головного мозга, «развращенного» пищевыми психостимуляторами типа легкоусваиваемых углеводов. 

2. Восстанавливает процессы пищеварения желудочно-кишечного тракта через нормализацию размеров и секреторной деятельности желудка, восстановление оптимального кровоснабжения тонкого и толстого кишечника, поджелудочной железы. 

3. Воздействует на блок тонуса головного мозга, активизируя основной обмен, тем самым уравновешивает гомеостатическую тенденцию организма к снижению скорости обменных процессов при снижении калорийности пищи. 

4. Повышает термогенез организма посредством стимуляции двигательной активности и микродвижений опорно-двигательного аппарата. 

5. Обучает на подсознательном уровне стратегии питания стройного человека и помогает сознательному переходу к основным принципам сбалансированного питания. 

6. Стирает программы выгодности переедания через процессы осознания и включения здоровых механизмов достижения психологического комфорта, тем самым, помогая изменению образа мышления и стиля жизни».

Психотерапевтические сеансы коннекционного блокирования осуществляются с помощью транса. 

Трансовые состояния являются разновидностью гипноза и связаны с усилением процессов торможения в коре головного мозга. Легкие степени транса достижимы любым психически полноценным человеком благодаря естественной способности к расслаблению. Большая часть информации, необходимой для инициации изменений, во время транса попадает непосредственно в подсознание, минуя фильтры сознания. Кстати сказать, между глубиной транса и результатом внушения нет никакой  прямой связи. Наоборот, высокая гипнабельность, во время которой пациент засыпает во время сеанса, зачастую только препятствует процессам переформирования привычек. 

Субъективно вы можете ощущать, что находитесь в трансе – по изменению глубины своего дыхания, обострению слуха, расслаблению целых мышечных групп, возникновению различных телесных ощущений, усилению способности вспоминать, представлять, фантазировать (в трансе активизируется правое полушарие головного мозга, ответственное за воображение и целостное восприятие себя и окружающего мира). Внешне человек, находящийся в трансе, напоминает глубоко задумавшегося, ушедшего в себя. 

Почему мы в своей работе прибегаем к помощи транса? Дело в особенностях человеческой психики. Внушения извне на находящегося в нормальном состоянии индивида, как правило, почти не действуют – какими бы разумными они ни были. Рассудок будет соглашаться с доводами, но внутреннее «я» человека, тем не менее, начнет активно защищаться, находя новые и новые контраргументы. В состоянии же транса барьеры сознания преодолеваются легко и свободно, желание защититься уходит (не от кого и незачем), и  голос  врача  является уже частью Вас самих… 

Коннекционный блок – это информация в виде строго структурированного, последовательного набора психотехнологий и суггестивных текстов, стирающая из Вашего подсознания ставшие деструктивными (разрушающими организм) старые программы пищевого поведения и обучающая новым, более эффективным способам общения с окружающим миром. 

Поскольку в основе ожирения, как мы уже убедились, лежит целый «букет» причин, лечение его тоже должно осуществляться комплексно. Не решив хотя бы одну, трудно говорить об успешных результатах. В некоторых лечебных учреждениях при лечении избыточного веса руководствуются принципом «клин клином вышибают». Исходя из этой установки, при помощи специальных приемов у пациентов формируют отвращение к некоторым видам пищи, подобно тому, как у алкоголиков – отвращение к спиртному. 

В Клинике «ИНСАЙТ» к такому подходу относятся с большой настороженностью. Во-первых, любой запрет долго не действует, во-вторых, здесь исходят из убеждения, что нет «плохих» продуктов. При разумном употреблении и в определенных ситуациях может быть полезным даже сало. Лишая организм тех или иных продуктов, можно вызвать несбалансированность питания. А чем менее сбалансирован рацион, тем скорее человек «соскочит» с диеты – как бы ни снижался при этом его вес. 

Врач-психотерапевт строит свою работу таким образом, что снижение веса  у пациента происходит плавно, постепенно, «экологично». Пациенты, находясь в этой программе, чувствуют себя достаточно комфортно, т. к. в ней отсутствуют запреты. В организме формируется система ограничений на так называемый «лишний кусок пищи». Как говорят пациенты: «Я ем все, что хочу, но понемногу – больше не лезет». Это дает возможность продолжать получать удовольствие от пищи, ведь вкусовые рецепторы находятся лишь в полости рта, а в желудке их нет, поэтому исчезает потребность набивать желудок пищей до отказа. Формируется так, называемая условно-рефлекторная связь, позволяющая чувствовать границы своего желудка. 

У многих пациентов меняются вкусовые пристрастия. Люди начинают отдавать предпочтение рыбе, фруктам и овощам перед мучной, жирной и сладкой пищей исходя не просто из полезности того или иного продукта, а из своих вкусовых ощущений.

Основной целью предлагаемой программы является формирование по окончанию курса лечения своего собственного «контролера» в отношении пищи на уровне автоматизма, что позволяет избежать так называемого «эффекта маятника», возвращающего сброшенные килограммы.  

Используя принцип комплексного подхода к лечению, врач-психотерапевт Елена Георгиевна Трубникова объясняет: «Наиболее эффективной является работа в системе: психотерапевт, диетолог, тренер в спортзале, массажист, врач-фитотерапевт. При необходимости в эту команду должны входить эндокринолог, косметолог и другие специалисты». 

Считая, что работа врача сводится к изменению привычек, образа жизни, нормализации эмоционального фона пациента, Елена Георгиевна в число причин, ведущих к возникновению ожирения, относит компульсии (вижу-хочу), отсутствие знаний о рациональном питании, определённый образ жизни и  существование проблем, заставляющих прибегать людей к «заеданию» гнетущих мыслей. 

Врач помогает больному не только избавиться от ненужных килограммов, но и закрепить достигнутый результат. Его союз с пациентом длится до года и далее в зависимости от сложности ситуации. За это время совместно корректируется образ жизни, переформировывается стереотип поведения, питания. Елена Георгиевна говорит: «Моя главная задача – помочь человеку сформировать безразличие к «вредным» продуктам питания, научить его обходить «подводные камни» в выборе тех или иных компонентов меню. Например, один по натуре сладкоежка и его постоянно тянет что-нибудь пожевать: конфету,  пирожное… Но ведь сладость сладости рознь. Вместо шоколадки можно съесть апельсин, сладкое яблоко. Не менее вкусно, а по количеству калорий – несопоставимо». 

Иногда приходится слышать такое мнение: «правильное» питание требует дополнительных расходов, его могут позволить себе лишь состоятельные люди. С этим утверждением Елена Георгиевна категорически не согласна: «Многие  жители города имеют дачные участки, выращивают овощи, фрукты и ягоды которые можно запасать на зиму и в свежем и в замороженном виде. Это неисчерпаемый источник витаминов, минеральных солей, пищевых волокон. Дорогую колбасу, копчености, жирное мясо без ущерба для бюджета можно заменить недорогими сортами рыбы, постным мясом, курятиной. Прекрасным источником белка являются нежирные молочные продукты, бобовые. Деньги можно потратить не на конфеты, шоколадки и печенье, а на фрукты и сухофрукты. Даже картофель можно «обезвредить», вымачивая  его  в очищенном виде перед варкой на 2,5 часа в холодной воде. За это время из него выходит значительное количество крахмала, который в организме мог преобразоваться в жиры.» 

Таким образом, дело вовсе не в средствах, а в сложившихся стереотипах поведения. Их изменить действительно сложно, как сложно научиться отличать аппетит от голода. Голод – это потребность организма в необходимом строительном материале, а аппетит – стремление получить удовольствие от пищи. Я  говорю своим пациентам: голод нельзя терпеть, есть нужно тогда, когда хочется, но понемногу и полезные продукты. Отличным другом «большого» человека может стать маленькая тарелка. Она помогает избежать соблазна переедания. 

К сожалению, многие утром выбегают из дому, не успев позавтракать. Обед заменяется перекусом – какой-нибудь булкой или хот-догом. К вечеру человек возвращается домой, терзаемый зверским голодом. В таком состоянии он начинает жадно и в огромном количестве поглощать любую пищу, не думая о последствиях. Это совершенно недопустимо. Очень осторожно следует относиться и к голоданию, устраиваемому с лечебными целями без наблюдения врача. Могут возникнуть нежелательные последствия. А вот разгрузочные дни, устраиваемые не чаще одного раза в неделю, оказывают очень благотворное действие на организм». 

В ходе лечения в Клинике «ИНСАЙТ» учитывается все: сложение человека, особенности его характера, тип темперамента и прочее. Исходя из этого, определяется стратегия сотрудничества доктора и больного. Энергичные и подвижные холерики, на первый взгляд, застрахованы от избыточного веса. Но иногда им бывают присущи эмоциональная неустойчивость, резкие смены настроения, которые в минуты «черных мыслей» толкают их к холодильнику с продуктами. Флегматик, в свою очередь, более устойчив к стрессу, но ему труднее изменить свой двигательный режим, перейти к активному образу жизни.  

Отличия в лечении избыточного веса зависят даже от половой принадлежности. У мужчин и женщин обмен веществ различен. У мужчин он протекает быстрее, поэтому в принципе мужчины полнеют реже женщин. У них менее часто возникает ожирение, связанное с расстройством гормональной деятельности. Если женщины часто полнеют в одиночестве, «заедая» свои психологические проблемы, то для мужчин более характерны коллективные «сеансы чревоугодия» – пикники на охоте, рыбалке, пивные посиделки. Во время этих мероприятий поглощается не только значительное количество спиртного (тоже, кстати, богатый источник калорий), но и всевозможных закусок. Сбрасывают лишний вес мужчины гораздо легче, но зато им труднее перестроиться на новый тип питания, основанный на низкокалорийной пище. 

Радикальное различие женского и мужского сознания заложено на уровне ДНК и количество отличий таково, что порой кажется, будто мужчина и женщина – два совершенно различных биологических вида. Отсюда и разный подход к лечению. 

На подсознательном уровне сознание женщины раздвоено. С одной стороны, ей хочется иметь красивую стройную фигуру, с другой – какая-то часть ее сознания активно сопротивляется занятию физкультурой, другим волевым усилиям, направленным на нормализацию веса. 

Механизм волевого включения у представительниц прекрасного пола чаще всего связан с прямой угрозой жизни. Биологические особенности и традиции воспитания формируют наших женщин альтруистками. Их с детства приучают думать в первую очередь о других: о детях, муже, членах семьи. Оказывать внимание самой себе, своему здоровью они привыкли в последнюю очередь, и финансирование этой статьи расходов в большинстве семей осуществляется по остаточному принципу. Поэтому, работая с женской аудиторией, врачу особенно важно иметь в виду: за проблемой избыточного веса у многих дам часто скрывается низкая самооценка, неумение правильно выстроить отношения в семье и многое другое. И один из них – улучшение собственного внешнего вида. Путей  к повышению собственной самооценки множество. В этом случае союзником психотерапевтов в Клинике «ИНСАЙТ» выступает врач — косметолог. Клиентам предлагается целый комплекс процедур, направленных на улучшение фигуры, укрепление  мышц. 

Нормализация веса – процесс длительный, требующий определенных усилий со стороны самого пациента, в этом убеждены все специалисты клиники «ИНСАЙТ». К сожалению, сейчас рекламируется немало «экспресс-методов» похудения, но все они далеко не безопасны для здоровья. Использование мочегонных, тиреоидных гормонов, «вытяжек» из гипофиза, по мнению многих медиков, устарело. Но и «волшебный» набор трав не может рассматриваться в качестве реальной альтернативы «экологическому» методу коррекции веса, так как в подобных наборах могут содержаться вещества с наркотическими или мало изученными свойствами. Растительное происхождение вещества не делает его безопасным. 

Врачи Клиники «ИНСАЙТ» в своей работе в ряде случаев прибегают к помощи фитотерапевтов, медикаментозной терапии – применению лекарственных препаратов, воздействующих на центры голода и насыщения, блокирующих всасывание пищевого жира. Но подходят они к этому крайне осторожно и только в комплексе с другими мерами. 

Противопоказаниями являются: серьезные психические и соматические расстройства, в том числе шизофрения, тяжелая сердечно-сосудистая недостаточность, гипертонический криз, беременность, кормление грудью, эндокринные заболевания в стадии обострения.

РАСCЧИТАТЬ СВОЙ НОРМАЛЬНЫЙ ВЕС

Прайс лечение избыточного веса

Трубникова Елена Георгиевна- врач-психотерапевт

Лубинец Александр Максимович- врач-психотерапевт

Кизим Елена Станиславовна- врач-психотерапевт

Метод академика Сергея Смелова

Что дает кодирование по Смелову при лечении лишнего веса и ожирения?

• После лечения снижается аппетит — насыщение происходит малым количеством продуктов.
• Исключаются тяжелые продукты: сладкое, мучное, жирное. Этих продуктов не захочется.
• Появляется дополнительная энергия и желание двигаться.
• Формируется более осознанный подход к своему питанию и здоровью. 

Какие условия лечения и наблюдения?

• Вначале всегда консультация и лекция по питанию. Затем психотерапевтический сеанс.
• После сеанса выдаются авторские методические рекомендации.
• Оплата однократная.
• Лечение за 1 сеанс.
• Длительность консультации и лечения около 1,5 часов. Если у пациента много вопросов — до 2-х часов.
• Лечение в группе или индивидуально.
• Лечение онлайн или офлайн (лично).

На чем основан метод лечения ожирения Сергея Смелова -метод эмоционально-стрессовой психотерапии?

В коре головного мозга расположен пищевой центр. Он объединяет два центра: аппетита и насыщения. При согласованной работе этих центров у человека происходит чередование таких ощущений: небольшое чувство голода и насыщение малым объемом.
Многие внешние факторы (чаще это стрессы) влияют на изменение активности пищевого центра – понижение или повышение. Повышение активности пищевого центра проявляется повышенным аппетитом и перееданием, а в комплексе с неправильным режимом питания (редкие приемы пищи и в основном на ночь) ведет к возникновению вначале избыточного веса, а затем и ожирения.
Вывод: таким образом, вес человека напрямую зависит от деятельности центральной нервной системы, от активности пищевого центра головного мозга. На снижение активности пищевого центра и направлен метод, разработанный Сергеем Смеловым.

Что происходит во время психотерапевтического сеанса?

Во время сеанса вы просто отдыхаете. Врач произносит определенный набор фраз-формул, погружая вас в измененное состояние сознания, более известное под названием поверхностное трансовое состояние или по-другому — поверхностный гипноз. Это не сон, но и не бодрствование. Легкое дремотное состояние, в котором вы находитесь, способствует достижению максимального эффекта во время сеанса. Вызываемый психотерапевтическими методами кратковременный психологический стресс приносит положительный эффект. Не затрагивая другие функции центральной нервной системы, оказывает воздействие на пищевой центр, снижая его активность.
В результате сеанса создается устойчивый отрицательный рефлекс по отношению к высококалорийной пище, снижается аппетит. В коре головного мозга создается стойкий доминантный очаг возбуждения нервных клеток и организм сам ставит себе предел калорийности пищи. Превышение этого предела может повлечь за собой неприятные ощущения: головокружение, рвоту, боль в области желудка. Ваш организм сам сигнализирует о том, сколько и какой пищи ему необходимо. И вы уже сами не сможете нарушить этот предел.

Что происходит в организме после сеанса?

После сеанса эмоционально-стрессовой психотерапии происходит интенсивная перестройка всех систем организма, восстанавливается нарушенный пищевой рефлекс. В результате этого устраняются нарушения жирового обмена, и вы плавно теряете лишний вес — от 2 до 5 кг в месяц. Это то, что теряется из жировой ткани. В течение первых нескольких недель вес может теряться чуть быстрее, особенно у людей с III-IV степенью ожирения. Это происходит за счет потери жидкости и освобождения кишечника. Затем этот процесс замедляется. Это нормальное явление, обусловленное физиологическими особенностями организма. В процессе сеанса лечебного гипноза снижается активность пищевого центра, снижается или подавляется аппетит. Вырабатывается устойчивый отрицательный рефлекс на высококалорийные продукты и большое количество пищи.
После сеанса в течение нескольких месяцев протекает адаптационный период, когда организм перестраивается на другой ритм работы. Во время сеанса существенно корректируются чувство голода и насыщения. Например, если раньше для утоления чувства голода вам нужно было съесть порцию какого-то блюда, то теперь достаточно будет 2-3 ложек, после чего возникнет чувство насыщения.
Лечение направлено на полную смену стереотипа питания, на исключение тяжелых продуктов, на снижение аппетита.

Кодируем от мучного и сладкого!

Закодироваться, чтобы не переедать | Клиника «Надежда»

Переедание и лишний вес — проблема, в первую очередь, психологическая, и ее необходимо решать. Ведь так хочется иметь стройное и подтянутое тело, быть здоровым, активным, полным сил и энергии. Можно ли изменить свои привычки за короткий срок? Можно ли сбросить лишние килограммы и похудеть? Это возможно. Для начала стоит закодироваться от переедания.

Вектор перемен

Пищевые пристрастия зависят от человека, его эмоционального состояния. Зачастую стрессы, скука, отсутствие интересов провоцируют чрезмерное потребление пищи. Тяга к еде также наблюдается у людей, которые не могут реализоваться, осуществить свои мечты, найти себя. Почувствовать счастье и радость им позволяет что-нибудь вкусненькое. Самостоятельно избавиться от зависимости возможно не всегда.

Хороший психотерапевт способен помочь отказаться от сладкого, мучной еды, настроить на перемены.

Кодирование — эффективный способ похудеть. Однако это не панацея. Следует помнить, что результат зависит от наличия мотивации у пациента. Готов ли он менять свое пищевое поведение, образ жизни.

Плюсы кодировки

Переедание — это не просто вредная привычка, это зависимость. Можно ли внушить желание бороться с лишними килограммами, заниматься спортом, правильно питаться, вести насыщенную жизнь? Можно ли закодироваться от еды? Безусловно, так как врач способен воздействовать на подсознание.

Несомненные плюсы кодирования:

• повышает мотивацию рационально питаться, заниматься физкультурой;
• настраивает на позитив, расслабляет, заряжает оптимизмом;
• позволяет побороть психологическую зависимость от сладкого, отказаться от вредных продуктов;
• регулирует обмен веществ на гормональном уровне.

Задача психотерапевта не просто закодировать человека от обжорства, внушить запреты на прием определенной пищи (мучного, сладкого, жареного, жирного), а помочь справиться с тревогами, стрессами, выяснить причину переедания. Только тогда правильные установки помогут разрушить старые пищевые привычки.

Суть кодировки

Кодировка — это погружение в транс и внушение специальных установок. Важно, чтобы это были не запреты, а жизнеутверждающие настройки: больше двигаться, есть овощи, а не выпечку или сладости, отдавать предпочтение здоровой пище, гулять.

Процедура кодировки от еды довольно проста.

1. Психотерапевт общается с пациентами, выясняет причину переедания, разъясняет, почему увлекаться сладостями, мучным, жареной и жирной пищей вредно с медицинской точки зрения.
2. Применяет гипноз, говорит медленно, используя определенные слова, внушает новые установки.
3. Рассказывает о правильном питании, о том, как держать себя в форме, разрабатывает специальную программу приема пищи.

В целом врач использует методы психолингвистического программирования, чтобы подавить желание постоянно жевать. Он повторяет одни и те же фразы, чтобы новые установки отложились в подсознании.

Первый шаг к здоровью

Как перестать переедать, как закодироваться от сладкого? Эту проблему решит психотерапевт. Кодировка помогает похудеть и снова не набрать лишнее. Кто-то избавляется от 30 кг, кто-то — от 10, кто-то — от 5. Ключевую роль здесь выполняет психологическая мотивация. Тот, кто изменяет свои привычки, худеет легко и впоследствии не набирает лишнее. Если человек после завершения кодировки возвращается к своим прежним пристрастиям, перестает заниматься спортом, он быстро набирает потерянные килограммы. К сожалению, установки не вечны. Они действуют от месяца до 2–3 лет, поэтому рекомендуется периодически повторять процедуру.

Обращайтесь за консультацией к специалистам нашей клиники. Они ответят на ваши вопросы и помогут решить проблему лишнего веса без применения хирургического вмешательства.

Коррекция веса по С.С.Смелову

ХУДЕЕМ ПО СМЕЛОВУ С.С. В «КОСМЕТОЛОГИИ №1»

НАМ ДОВЕРЯЮТ

Способ коррекции веса при помощи психотерапии разработан и запатентован в 1994 году академиком Смеловым Сергеем Станиславовичем. Одобрен Институтом питания. В Оренбурге применяется с 1995 года.Вот что говорит об этом врач психиатр, психотерапевт, кандидат медицинских наук Голенищенко Андрей Викторович.- У нас более половины населения страдает от избыточного веса. Ожирение-это не просто испорченная фигура, а это заболевание, приводящее к атеросклерозу, инсультам, инфарктам, сахарному диабету, остеохондрозу и др.  Это может быть просто переедание или патологическое изменение внутренних органов, отвечающих за обмен веществ.Для борьбы с излишним весом в мире придумано тысячи способов, пилюль, диет дающих  непродолжительный эффект .Первое с чего мы начинаем : даем установку на здоровое питание без продуктов, от которых поправляются (картофель, мучное, сладкое), помогаем  выработать правильный стереотип питания.

После однократного сеанса снимается тяга к этим продуктам. Без усилия воли, совершенно спокойно, человек может обходиться без этих продуктов. Уменьшается объем съедаемой пищи. После сеанса вы уже не будете испытывать острого голода  и непреодолимого желания много есть.Вторая задача- активизировать обменные процессы в организме , чтобы все съеденные продукты питания сгорали. Это достигается активным образом жизни, движением : ходьба, бег, посещение бассейна, танцы, лыжи, коньки, спортивные игры, Наш организм нуждается в очищении, но не слабительными препаратами и клизмами. Эти способы противоестественны, а рекомендуется провести мониторную разгрузку, тюбажи печени, принимать в пищу чернослив, курагу, инжир, яблоки, пить минеральную воду, применять раздельное питание. Разгрузку  можно проводить еженедельно при помощи разгрузочных дней в течении всей жизни. Сжигать надо больше чем съедать,  а с ростом веса снижается подвижность. Когда неправильно выбрана диета , человек изможден, испытывает стресс, ходит с серым лицом и потухшими глазами.

После нашего сеанса психотерапии появляется прилив энергии: хочется двигаться, резкого снижения веса у нас нет. Оптимально до 5 кг. в месяц, бывает до 10 кг. (если изначально был большой вес). Быстро худеть вредно для организма из-за выработанного гомеостаза (постоянства внутренней среды).Если за полгода стереотип питания не выработался, то пациент приходит на повторный сеанс, чтобы закрепить результат и поддерживать стереотип питания всю жизнь и довольно успешно в 85% случаев.

По ВОЗ ( Всемирной Организации Здравоохранения) рекомендуется комплексный подход: не только  правильное питание, движение, но и включаются дополнительные методики- рефлексотерапия в точки снижения аппетита, которые пациент запоминает и использует при взгляде на запрещенный продукт.  Перед сеансом врач выясняет общее состояние здоровья, учитывет противопоказания, рекомендует подготовку без которой пациент к сеансу не допускается. 

О наличии противопоказаний проконсультируйтесь со специалистом!

Проводится сеанс по субботам с 8-30 до 11-30.

Добро пожаловать. Мы ждем вас по адресу:

Г.Оренбург, ул.Терешковой, 4а ООО Медицинский Центр «Косметология № 1»

г. Оренбурга

Пищевая зависимость. Лечение в Минске по низким ценам

«Обычный человек поест — и сыт,
А жадный взять побольше норовит.
Он ненасытный всё сгребает в рот,
Покуда смерть его не приберёт.»
(Ю.Баласагуни)

ОЖИРЕНИЕ – ЭПИДЕМИЯ ТРЕТЬЕГО ТЫСЯЧЕЛЕТИЯ?

Неприятный вопрос стоит в заглавии. Эпидемия – это как стихийное бедствие и от человека не зависит. Каждый может оказаться жертвой эпидемии. А так ли это? Вовсе и не так! Есть, дорогие мои, в ожирении, да и в избыточном весе и Ваша личная ответственность. Лишь в небольшом количестве случаев ожирение обусловлено болезнью, во всех же остальных случаях речь о зависимости от пищи, когда человек «в жратву бежит» от всех проблем: грустно – надо поесть, радостно – садимся праздновать, скучно – жуем, веселимся – активно едим, одиноко – кушаем много, медленно и печально.

 

По оценке Всемирной организации здравоохранения свыше миллиарда человек в мире имеют лишний вес. Предлагаем Вам метод лечения избыточного веса позволит взять власть над пищей – и это будет в ваших силах.

 

Как освободиться от пищевой зависимости

 

Вы можете сами определить, имеется ли у Вас избыточный вес, и рассчитать ваш ИНДЕКС МАССЫ ТЕЛА (ИМТ):

     Вес (кг.)
И М Т = ——————
          {Рост (м)}²

Если ИМТ равен 25 и меньше – это нормальный вес.

Если ИМТ больше 25 – это избыточный вес.

Если ИМТ свыше 30 – это ожирение.

Наш сайт — для тех, кто принял решение начать бескомпромиссную борьбу с избыточным весом, ожирением.
 

КАК ПОДГОТОВИТЬ СЕБЯ К ПРОГРАММЕ ПОХУДЕНИЯ. 

 

Похудеть мечтают многие люди. Я знаю, что похудеть трудно, но я знаю, что это возможно, так как занимаюсь этой проблемой 18 лет. Для этого придется взять на себя определенные обязательства и внутренне подготовиться. Задайте себе вопрос: «Зачем мне худеть?». Причина должна быть важной и весомой именно для Вас. Вы нашли стимул, есть мотив, есть устойчивое желание… А как насчет готовности приложить усилия? Вам придется пересмотреть свой образ жизни. Вы готовы к этому? Остается только одно – принять решение и приступить к его выполнению.

Стимул – мотив – устойчивое желание – готовность приложить усилия – решение – действие.

А перед тем как прийти на лечение (психотерапевтический сеанс) по поводу избыточного веса, Вам следует полностью воздержаться от приема пищи в течение 36 часов, пить только воду (простую, минеральную, но не сладкую).
 

МЕТОД ЛЕЧЕНИЯ ИЗБЫТОЧНОГО ВЕСА, ПРИМЕНЯЕМЫЙ В НАШЕМ ЦЕНТРЕ.  

 

Итак, мы установили, что ожирение и избыточный вес – это пищевая зависимость. А это значит, что корень проблемы гнездится в голове, точнее – в сознании человека, не извлечешь корень – не избавишься от проблемы. Именно поэтому в лечении пищевой зависимости я использую уникальный модифицированный метод эмоционально – стрессовой психотерапии по доктору А.Р. Довженко.

Во время сеанса, проводимого в состоянии легкого лечебного транса, в подсознание пациента вводятся новые программы специальной информации с учетом сознательно выбранного Вами искреннего желания похудеть, которые связываются с имеющимися у Вас резервными возможностями и, тем самым, Вы избавляетесь не только от избыточного веса, но и от мыслей, породивших пищевую зависимость (см. статью «О кодировании»).

В результате: 

 

• Снижается патологическая активность аппетита в головном мозгу.
• Восстанавливаются процессы пищеварения в желудочно-кишечном тракте.
• Активизируются процессы основного обмена.
• Стимулируется двигательная активность.
• Стирается программа «приятности» переедания.

Как и любой другой метод лечения, этот метод также имеет свои противопоказания: 

 

• Манифестные психические заболевания.
• Онкологические заболевания.
• Инсулиново-зависимый сахарный диабет.
• Прием кортикостероидных гормонов.
• Беременность.

 
Всех своих пациентов после лечения мы наблюдаем в течение года.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ

 
За 18 лет работы в центре пролечено более 6 тысяч пациентов с нарушением пищевого поведения и 91 % этих людей добились поставленной цели и избавились от полноты. А главное, им без труда удается поддерживать свой новый нормальный вес. И, в первую очередь, этому способствует внедрение в метод эмоционально-стрессовой психотерапии по А.Р. Довженко реабилитационной программы, включающей:

• Простое разумное питание – это не диета и тем более не “очередная диета”. Разумное питание – это простое питание, придерживаться которого так же просто и естественно, как переходить дорогу, руководствоваться правилами дорожного движения.
• Обучение пациентов приемам самоусиления психологического антиаппетитного кода.

 

1. Фотографии пациентки до лечения и после лечения:
(1968 года рождения. Рост 1,65 см)

 

    2007 год — вес 128 кг                2008 год — вес 84 кг (-44 кг)

 

2. Фотографии пациентки до лечения и после лечения:
 

 

    До лечения — вес 82 кг                После лечения — вес 56 кг (-26 кг)

 

3. Фотографии пациентки до лечения и после лечения:

 

    До лечения — вес 95,8 кг (08.09.16)                После лечения — вес 75 кг (-20,8 кг) (01.03.17)

 

В октябре 2008 года одна из пациенток прислала письмо и фотографии, отражающие результаты проведенного лечения.

«Дорогая Ирина, это письмо только лишь слабая попытка сказать Вам спасибо, т.к. ни в одном из языков мира нет слов, чтобы выразить, как я вам благодарна.
Многие годы я страдала избыточным весом. Я перепробовала все диеты, которые только есть и каждый раз, в конечном счете, набирала еще больше килограмм, чем потеряла.
Десять лет назад я попала в страшную аварию и на долгие годы села в инвалидную коляску, что только усугубило мои проблемы с излишним весом.
Полтора года назад я прошла курс лечения пищевой зависимости и с тех пор постепенно теряю вес. Но самое главное — еда больше не контролирует мою жизнь!!!
Спасибо Вам за то, что теперь я знаю, как жить дальше, и впервые за 40 лет я держу себя в руках. Еда больше никогда не победит меня. Я – здорова и иду по жизни с высоко поднятой головой!»

Интересно? Тогда ждем Вас.

И. Донская

Для лечения пищевой зависимости необходимо:  

• наличие желания самого больного вылечиться от пищевой зависимости;
• воздержаться от приема пищи в течение 36 часов до лечения от пищевой зависимости, пить только воду.

 
 

ПОМНИТЕ! ВАШИМ ДЕВИЗОМ ДОЛЖЕН СТАТЬ ДЕВИЗ ДОКТОРА ДОВЖЕНКО: «ПОМОГИ СЕБЕ САМ!»

Лечение ожирения методом кодирования по японской технологии

Вопрос «как быстро скинуть вес» – один из самых распространенных в любой поисковой системе.

Избыточный вес – проблема многих людей. В результате набора веса появляются проблемы не только эстетического плана, но и практические. Ухудшается здоровье: появляется одышка, начинаются проблемы с сердечно-сосудистой системой, большой вес быстро приводит к изношенности суставов, особенно страдают при этом колени и позвоночник. Поглощение еды становится главным удовольствием – и человеку неважно, что пищеварительная система не способна усвоить всю пищу без вреда для себя, поэтому начинаются проблемы с желудком, кишечником, печенью.

Какие факторы приводят к ожирению?

Причин этому состоянию много: нездоровое питание с большим содержанием жиров и рафинированных углеводов, сидячая работа, передвижение с минимальным расходом энергии. Появилось такое понятие, как «полнота бедных» — люди с ограниченными финансовыми возможностями потребляют большое количество доступных по стоимости углеводов (картошки, макарон) вместо овощей и белков (мяса, яиц, молокопродуктов).

Но существует еще такое понятие, как психологическая полнота! Многие люди заедают вкусняшками стресс, кушают столько, чтобы наесть «броню из жира», которая защищает психологически от мира, в котором отсутствует любовь. Люди в состоянии стресса забывают, что пять минут назад рассуждали на тему «хочу похудеть»

Отдельной проблемой становятся генетические отклонения и гормональные проблемы в результате различных заболеваний, которые также приводят к ожирению. Многие специалисты утверждают, что эти факторы не являются решающими, но они тоже имеют определенное значение.

Почему самостоятельное похудение не дает желаемых результатов?

Похудеть самостоятельно хоть раз пробовал каждый. Люди стараются придерживаться низкокалорийных диет или садятся на монодиеты, сбрасывают определенное количество килограммов – но затем проявляется «эффект маятника» и вес восстанавливается. Организм стремится возместить «убытки», усваивает каждую калорию в режиме «голода» и стремится экономить расход энергии, поэтому при жесткой диете и после нее человек чувствует себя вялым.

Постоянно сидеть на разрекламированных диетах вредно для здоровья – организм недополучает не только калорий, но и витаминов, белков, различных микроэлементов. Длительное питание по диете для похудения приводит к ухудшению состояния здоровья – первыми внешними симптомами становятся проблемы с кожей и волосами.

Что такое «кодирование от ожирения»?

Нужно искать ответ на вопрос не «как быстро похудеть?», а «как похудеть надолго?».

Наша клиника лечения ожирения работает, создавая психологические установки на похудение и здоровое питание. Лечение ожирения кодированием предполагает, что центр, который в мозгу отвечает за удовольствие от еды и посылает импульсы голодного неудовольствия при любом случае (от стресса в том числе) работал в нормальном режиме. В таком случае еда становится источником энергии и полезных веществ.

Человек, забивающий в поисковик «хочу похудеть самый эффективный способ», обычно рассчитывает на один-два визита к специалисту. Но высококвалифицированный специалист может потратить больше времени на диагностику, чтобы найти причину отклонений. Качественное кодирование предполагает работу с причинами, а не механическую регулировку аппетита.

Страстное желание «хочу быстро похудеть» появляется перед свадьбой, встречей выпускников. И кодирование поможет привести тело в форму при помощи уменьшения калорийности питания. Но чтобы удержать эффект надолго, желательно продумать систему физической активности и поддерживать здоровый образ жизни постоянно.

Преимущества кодирования:

 эффективность метода;

 

•  минимум усилий со стороны худеющего;
• длительный эффект;
• позитивное настроение во время похудения;
• доступная стоимость.

 

Недостатки метода в том, что существуют люди с низкой внушаемостью, недостаточно открытые, с которыми психотерапевту работать трудно, особенно методом гипноза.

Кодирование поможет тем, кто осознает свою проблему и сам стремится ее решить.

Идентификация генов, кодирующих связанную с гранулами синтазу крахмала, участвующую в метаболизме амилозы в банановых фруктах

Abstract

Гранулированная синтаза крахмала (GBSS) отвечает за синтез амилозы, но роль генов GBSS и их кодируемых белков остается плохо изученной в банане. В этом исследовании содержание амилозы и активность GBSS постепенно увеличивались во время развития плодов банана и снижались при хранении зрелых плодов.Белок GBSS в гранулах бананового крахмала составлял приблизительно 55,0 кДа. Экспрессия белка повышалась во время развития, тогда как при хранении экспрессия снижалась. Шесть генов, обозначенных как MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-3 , MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 , были клонированы и охарактеризованы из плодов банана. Среди шести генов характер экспрессии MaGBSSI-3 наиболее соответствовал изменениям содержания амилозы, активности фермента GBSS, уровня белка GBSS и количества или размера гранул крахмала в плодах банана.Эти результаты предполагают, что MaGBSSI-3 может регулировать метаболизм амилозы, влияя на изменение уровней GBSS и количества или размера гранул крахмала в плодах банана во время развития или хранения.

Образец цитирования: Miao H, Sun P, Liu W, Xu B, Jin Z (2014) Идентификация генов, кодирующих гранулированную синтазу крахмала, участвующую в метаболизме амилозы в плодах банана. PLoS ONE 9 (2): e88077. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088077

Редактор: Тай Ван, Институт ботаники Академии наук Китая, Китай

Поступила: 26 июля 2013 г .; Принята к печати: 5 января 2014 г .; Опубликован: 4 февраля 2014 г.

Авторские права: © 2014 Miao et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Работа финансируется Министерством науки и технологий Китайской Народной Республики (№ 2011AA10020605) и Системой исследования современных агропромышленных технологий (nycytx-33). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Крахмал является основным углеводом, потребляемым для питания человека, а также основным компонентом злаков, клубней, бобовых и фруктов. Крахмал состоит из смеси двух разных углеводов, а именно амилозы (20–30%) и амилопектина (70–80%) [1] — [3]. Амилоза — это линейный полимер, состоящий из остатков глюкозы, соединенных α-1,4-глюкозидными связями, и его синтез в основном катализируется за счет активности синтазы связанного гранулами крахмала (GBSS).GBSS переносит глюкозильный остаток от ADP-Glu на глюкановые субстраты для образования относительно длинноцепочечных молекул амилозы [4]. Содержание амилозы напрямую влияет на консистенцию и вкус зерна злаков [5]. Физическая структура амилопектина оказывает важное влияние на кристаллические свойства кукурузы [5], а для его синтеза необходимы растворимые синтазы крахмала (SS), ферменты разветвления крахмала (SBE) и ферменты разветвления крахмала (DBE) [4].

Белки

GBSS имеют решающее значение в регуляции образования амилозы.Ингибирование экспрессии GBSSI с помощью РНКи-интерференции привело к получению не содержащего амилозы трансгенного сладкого картофеля [6]. Активность GBSS и содержание амилозы также значительно снизились после подавления РНК экспрессии гена GBSSI в эндосперме пшеницы [7]. Полноразмерная смысловая кДНК, кодирующая сладкий картофель GBSSI , управляемая промотором 35S CaMV, была введена в сладкий картофель с помощью трансформации, опосредованной Agrobacterium tumefaciens . У одного из 26 полученных трансгенных растений в клубневых корнях отсутствовала амилоза [8].Недавно, благодаря регулируемой экспрессии гена GBSS в сладком картофеле, был получен крахмал с различным соотношением амилоза-амилопектин. Крахмал с низким содержанием амилозы можно использовать в пищевой промышленности, а крахмал с высоким содержанием амилозы полезен в кондитерской промышленности и для синтеза пластмасс [9].

Белки

GBSS также известны как восковые белки [10]. У однодольных растений GBSS делится на два семейства: GBSSI и GBSSII. Транскрипты GBSSI преимущественно обнаруживаются в эндосперме, эмбрионах и пыльце, в то время как транскрипты GBSSII экспрессируются в не запасающих тканях, таких как листья, стебли, корни и другие органы [11].Напротив, все генов GBSS у эвдикотов принадлежат к семейству GBSSII, и их экспрессия соответствует паттерну, наблюдаемому для генов GBSSII у однодольных. Это говорит о том, что подсемейство GBSSI было потеряно в процессе эволюции, приведшей к возникновению эвдикотов [1]. На сегодняшний день последовательность и экспрессия генов GBSSI охарактеризованы в кукурузе [12], рисе [13], ячмене [5], пшенице [11], горохе [14], картофеле [15] и сладком картофеле [ 8]. GBSSII генов были выделены из риса [13], пшеницы [11], яблока, персика и апельсина [1].Однако полная последовательность и паттерны экспрессии этих генов из плодов банана еще не сообщены. Чтобы облегчить дальнейшие исследования крахмала плодов банана, важно охарактеризовать гены банана GBSSI и GBSSII в банане.

Банан ( Musa spp.) Является основным продуктом питания в тропиках. Его плоды жизненно важны для продовольственной безопасности во многих тропических и субтропических странах, а банан также является одним из самых популярных фруктов в промышленно развитых странах [16] — [17].Крахмал является основным компонентом зеленых банановых плодов и присутствует на уровне примерно 61,3–76,5%, что достаточно для очистки крахмала в промышленных масштабах [12]. Недавно была опубликована полная последовательность генома банана (http://banana-genome.cirad.fr/). Эта база данных геномных последовательностей предоставляет уникальные возможности для полногеномного исследования генов, участвующих в синтезе крахмала плодов банана. В этом исследовании мы исследовали изменения содержания амилозы, активности фермента GBSS и белка GBSS от доуборочного до послеуборочного периода банана ( Musa acuminata L.AAA group cv. Бразильский) фрукт. Были клонированы шесть генов MaGBSS , и их характеристики последовательности, хромосомное положение и паттерны экспрессии были изучены в различных тканях и на разных стадиях развития или хранения плодов. Также наблюдали количество, размер и форму гранул крахмала в плодах банана во время развития и хранения.

Результаты

Изменения общего содержания крахмала, содержания амилозы и активности GBSS

Общее содержание крахмала постепенно увеличивалось во время развития плодов банана, но снижалось после сбора урожая (рис. 1А и 1Б). Содержание амилозы в мякоти увеличивалось от 0 до 50 дней развития плода и снижалось через 60 дней. Содержание амилозы также постепенно снижалось от 0 до 30 дней хранения (фиг. 1C и 1D). Увеличение активности GBSS произошло от 0 до 50 дней развития, но снизилось через 60 дней, в то время как активность GBSS резко снизилась с 0 до 30 дней хранения (рис. 1E и 1F).

Рис. 1. Изменения общего содержания крахмала (A, B), содержания амилозы (C, D) и активности GBSS (E, F) в мякоти банана на разных стадиях развития и хранения.

Вертикальные полосы представляют собой стандартную ошибку (± SE) трех повторов. Было проведено три биологических эксперимента, которые дали аналогичные результаты.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088077.g001

SDS-PAGE и вестерн-блоттинг-анализ белка GBSS

Чтобы определить, содержит ли крахмал плодов банана белок GBSS, были выделены гранулы крахмала в мякоти банана; Белок GBSS очищали и анализировали в гелях SDS-PAGE (фиг. 2A).Белок GBSS массой 55,0 кДа был перенесен в пульпу с помощью вестерн-блоттинга (фиг. 2В). Экспрессия белка GBSS постепенно повышалась во время развития плодов банана, но снижение наблюдалось от 0 до 30 дней хранения (фиг. 2B). Эти результаты SDS-PAGE и вестерн-блоттинга согласуются с изменениями содержания амилозы (фиг. 1C и 1D) и активности GBSS (фиг. 1E и 1F) во время развития и хранения бананов.

Рисунок 2. SDS-PAGE и вестерн-блоттинг-анализ белков GBSS в мякоти банана на разных стадиях развития и созревания.

M1: Белковый маркер; A: SDS-PAGE; B: Вестерн-блоттинг; а: изменение уровней белка GBSS на разных стадиях развития плодов банана с помощью анализа SDS-PAGE; b: изменение уровней белка GBSS на разных стадиях созревания плодов банана с помощью анализа SDS-PAGE; c: изменение уровней белка GBSS на разных стадиях развития плодов банана по данным вестерн-блоттинга; d: изменение уровней белка GBSS на разных стадиях созревания плодов банана по данным вестерн-блоттинга. Каждая дорожка содержала 20 мкл белкового экстракта GBSS.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088077.g002

Характеристики нуклеотидной последовательности и хромосомная локализация шести генов

GBSS в банане

Шесть генов, кодирующих членов семейства GBSS , обозначенных как MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-3 , MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGB6SSII-2 клонирован из банана.Полноразмерные кДНК, кодирующие MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-3 , MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 , были 1851 bp (номер доступа 202020). , 1851 п.н. (номер доступа KF512021), 675 п.н. (номер доступа KF512022), 1845 п.н. (номер доступа KF512023), 2265 п.н. (номер доступа KF512024) и 906 п.н. (номер доступа KF512025), соответственно. Гены, кодирующие MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 и MaGBSSI-4 , содержат 13 экзонов и используют TGA в качестве стоп-кодона. MaGBSSI-3 состоит из 6 экзонов и использует TAG в качестве стоп-кодона. MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 содержат 10 экзонов и 1 экзон, соответственно, и используют TAA в качестве стоп-кодона (рис. S1). Шесть генов, кодирующих членов семейства MaGBSS , были обработаны методом BLAST с использованием базы данных последовательностей генома бананов (http://banana-genome.cirad.fr/). MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 и MaGBSSI-3 рассредоточены по хромосоме 3. MaGBSSII-1 , MaGBSSII-2 и MaGBSSI-4 расположены на хромосомах 4, 8, 8, 8 и . и 9 соответственно (рис.S1).

Анализ аминокислотной последовательности шести генов

MaGBSS

Выведенные аминокислотные последовательности кДНК шести белков MaGBSS в банане разделяли три консервативных области, обозначенных как Box1, Box2 и Box3 (рис. S2). По сравнению с аминокислотными последовательностями MaGBSSI-1, MaGBSSI-2, MaGBSSI-4 и MaGBSSII-1 в блоке 1 MaGBSSI-3 и MaGBSSII-2 отсутствовали 14 аминокислот (PWSKTGGLGDVLGGLP). Что касается последовательности Box 2 (TSRFEPCGL) MaGBSSI-1, MaGBSSI-2 и MaGBSSI-4, было 5 аминокислотных различий (T → S, F → M, P → F, C → Q, G → N ) в ящике 2 MaGBSSI-3 (рис.S2). Прогнозируемые молекулярные массы пептидов MaGBSSI-1, MaGBSSI-2, MaGBSSI-3, MaGBSSI-4, MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 составляли 67,7 кДа, 68,0 кДа, 55,6 кДа, 67,7 кДа, 83,6 кДа и 34,0 кДа. соответственно. Белок MaGBSSI-3 имел вес 55,6 кДа согласно анализу программного обеспечения pI / MW (http://expasy.org/compute.pi/), что соответствовало белку GBSS, обнаруженному с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга (рис. 2A. и 2Б).

Анализ аминокислотной последовательности показал, что MaGBSSI-1 имеет наиболее близкое родство с MaGBSSI-2 и имеет 82% идентичность аминокислот, за которыми следуют MaGBSSI-4 и MaGBSSI-3 (рис.3). MaGBSSII-1 имел самое близкое родство с MaGBSSII-2 и имел 84% аминокислотную идентичность, за ним следует Vitis vinifera (XP002278470) (рис. 3). Филогенетическое дерево показало, что шесть аминокислотных последовательностей MaGBSS из плодов банана очень консервативны и имеют высокое сходство последовательностей с другими видами растений (рис. 3).

Рисунок 3. Филогения аминокислотных последовательностей MaGBSSI и MaGBSSII.

Austrostipa aristiglumis GBSSI (ABU98330), Microlaena stipoises GBSSI (ABU99332), MaGBSSI-1, MaGBSSI-2, MaGBSSI-3 и MaGBSSI-4 ( Musa acuminate AAA group cv. Brazilian), Castilleja ambigua GBSSI (ACZ73348), Junellia seriphioides GBSSI (ABQ52190), Malus × domestica GBSSI-2 (ACB97678), Nelumbo nucifera GBSSI39 (AC0006 GBSSI) (AC0006 GBSSI) (AC0006 GBSSI) (AC0006 GBSSI , Malus × domestica GBSSI-1 (ACB97677), Glycine max GBSSI-1 (NP001237971), Vigna unguiculata GBSSI-1 (ABP35818), Lotus japonicus GBSSI-1 (ACB GBSSI-1) (ACB GBSSI-1) (ACB GBSSI-1) (ACB GBSSI-1) (ACB GBSSI-1) GBSSI-2 (ACB30385), Phaseolus vulgaris GBSSI-2 (BAC76613), Vigna radiata GBSSI-2 (ACB30382), Cicer arietinum GBSSII (XP004489397), 9000II 9 Pisum GBSSI (XP004489397), 9000II 9000II GBSSI30 и MaGBSSII-2 ( Musa acuminate L. AAA group cv. Brazilian), Vitis vinifera GBSSII (XP002278470), Solanum lycopersicum GBSSII (XP004232219), Solanum tuberosum GBSSII (Q43847), Manihot esculenta GBSSII) (AAF13168II) (AAF13168. Числа, представленные в процентах, указывают на идентичность аминокислотных последовательностей MaGBSSI и MaGBSSII разных видов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088077.g003

Экспрессия генов

MaGBSSI и MaGBSSII в тканях банана

Q-RTPCR выявил достоверные различия в экспрессии MaGBSSI и MaGBSSII в разных тканях банана (рис.4). MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 были активированы в вегетативных тканях, таких как корень, стебель, лист и прицветник. Напротив, MaGBSSI-3 высоко экспрессируется в репродуктивных тканях, таких как цветок, кожура и мякоть, но слабо экспрессируется в корне, стебле и листе. Эти результаты предполагают, что MaGBSSI-3 может участвовать в метаболизме амилозы в репродуктивных тканях.

Рисунок 4.Экспрессия генов MaGBSSI и MaGBSSII в различных тканях банана.

Ось ординат представляет относительную кратную разницу в уровне мРНК, которая рассчитывается с использованием формулы 2 ^{— ΔΔCt} с MaActin в качестве внутреннего контроля. Относительные уровни экспрессии представлены как кратные изменения относительно уровня экспрессии, полученного в ткани корня. Вертикальные полосы представляют собой стандартную ошибку (± SE) трех повторов. Было проведено три биологических эксперимента, которые дали аналогичные результаты.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088077.g004

Экспрессия шести генов

MaGBSS и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) гранул крахмала на разных стадиях развития плодов банана

Экспрессию генов MaGBSSI и MaGBSSII на разных стадиях развития плодов банана определяли с помощью Q-RTPCR. Уровни экспрессии MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 на более ранних стадиях развития бананов (от 0 до 30 дней) были выше, чем поздние стадии (от 30 до 60 дней).Напротив, MaGBSSI-3 слабо экспрессировался на ранних стадиях, но был сильно усилен (приблизительно в 50 раз) на 50 дн развития (фиг. 5A). Эти результаты предполагают, что MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 могут быть задействованы на ранних стадиях (0-30 дней) крахмала. granule-fill, и MaGBSSI-3 может участвовать на более поздних стадиях (30–60 дней) наполнения крахмальных гранул во время развития плодов банана (рис.5А).

Рисунок 5. Экспрессия генов MaGBSS (A) и сканирующая электронная микроскопия (SEM) гранул крахмала (B) на разных стадиях развития в плодах банана.

Ось ординат представляет относительную кратную разницу в уровне мРНК, которая рассчитывается с использованием формулы 2 ^{— ΔΔCt} с MaActin в качестве внутреннего контроля. Относительные уровни экспрессии представлены как кратные изменения относительно уровня экспрессии, полученного на 0-й день развития плода.Вертикальные полосы представляют собой стандартную ошибку (± SE) трех повторов (A). Красная стрелка представляет гранулы крахмала. Было проведено три биологических эксперимента, которые дали аналогичные результаты.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088077.g005

Гранулы крахмала в плодах банана через 0, 30 и 60 дней развития плода наблюдали с помощью SEM. Гранулы едва ли можно было наблюдать в 0 дней, но количество и размер овальных гранул значительно увеличились через 30 дней развития.По сравнению с гранулами через 30 дней количество и форма гранул через 60 дней были аналогичными, но они были значительно больше (фиг. 5B). Эти результаты показывают, что первые 30 дней развития плода могут иметь решающее значение для определения окончательного количества и формы гранул крахмала в плодах банана. 30–60 дней развития плода, по-видимому, являются фазой быстрого наполнения гранул крахмала. Эти результаты согласуются с профилем экспрессии MaGBSSI-3 во время развития плодов банана.

Экспрессия шести генов

MaGBSS и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) гранул крахмала после хранения зрелых плодов банана

Сходные профили экспрессии MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-4, MaGBSSII-1, и MaGBSSII-2 были обнаружены в естественно созревших плодах банана в разное время хранения. Их экспрессия увеличивалась с 0 до 15 дней хранения, снижалась в момент времени 20 дней, а затем снова увеличивалась до 30 дней хранения.Напротив, непрерывное снижение экспрессии MaGBSSI-3 происходило с 0 до 30 дней хранения. Ген был обильно экспрессирован только на ранних стадиях (от 0 до 10 дней) созревания плодов и едва обнаруживался на более поздних стадиях (10–30 дней) хранения плодов (рис. 6A). Этот паттерн экспрессии MaGBSSI-3 согласуется с деградацией банановых белков GBSS во время хранения.

Рисунок 6. Экспрессия генов MaGBSS (A) и сканирующая электронная микроскопия (SEM) гранул крахмала (B) в плоде банана, хранящемся в течение различных периодов времени.

Ось ординат представляет относительную кратную разницу в уровне мРНК, которая рассчитывается с использованием формулы 2 ^{— ΔΔCt} с MaActin в качестве внутреннего контроля. Относительные уровни экспрессии представлены в виде кратных изменений относительно уровня экспрессии, полученного на 0-й день после сбора урожая. Вертикальные полосы представляют собой стандартную ошибку (± SE) трех повторов (A). Красная стрелка представляет гранулы крахмала. Было проведено три биологических эксперимента, которые дали аналогичные результаты.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088077.g006

Гранулы крахмала также наблюдались в зрелых плодах банана с использованием SEM после 0, 5 и 10 дней хранения. Гранулы крахмала были обнаружены в первый момент времени (0 дней), и после этого количество гранул значительно уменьшилось. Меньшее количество гранул наблюдалось через 5 дней хранения, и гранулы не могли быть обнаружены через 10 дней хранения (фиг. 6B). Эти результаты предполагают, что гранулы крахмала быстро разлагаются во время хранения плодов банана, а также согласуются с паттерном экспрессии MaGBSSI-3 во время хранения плодов банана.

Обсуждение

Изменения содержания амилозы, активности фермента GBSS и белка GBSS

Содержание амилозы — важный фактор, влияющий на урожайность и качество плодов банана. Slack и Wainwright [18] сообщили, что содержание амилозы постепенно увеличивается в процессе развития ячменя, а фермент GBSS играет ключевую роль в синтезе амилозы [19]. В этом исследовании изменения содержания амилозы и активности фермента GBSS были обнаружены во время развития и хранения плодов банана.Содержание амилозы и активность фермента GBSS постепенно увеличивались во время развития плодов банана, но значительно снижались во время хранения (рис. 1C и 1D; рис. 1E и 1F). Таким образом, регулирование содержания амилозы и активности фермента GBSS является многообещающим методом повышения урожайности и качества плодов банана.

В нашем исследовании белок GBSS, очищенный из плодов банана, имел приблизительно 55,0 кДа (рис. 2A и 2B). Эта молекулярная масса аналогична белкам GBSS, очищенным из риса (56 кДа) [20], кукурузы (58 кДа) [21] и коровьего гороха (58 кДа) [22].SDS-PAGE и вестерн-блоттинг-анализы показали, что белки GBSS банана накапливались во время развития плодов банана, и их уровни снижались во время хранения плодов (рис. 2A и 2B). Эти результаты согласуются с изменениями содержания амилозы и активности фермента GBSS из плодов банана.

Анализ последовательности

генов GBSS

В этом отчете шесть генов MaGBSS были секвенированы и охарактеризованы из плодов банана. MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MdGBSSII-1 и MaGBSSII-2 каждый имеет 13 экзонов и три консервативных области (Box1, 2 и 3) (рис. S1 и рис. S2). Структура этих генов GBSS банана аналогична структуре генов GBSS , характерных для риса [13], кукурузы [12], сладкого картофеля [8], амаранта [10], яблока, персика и апельсина [1] . Мы предполагаем, что MaGBSSII-2 является псевдогеном. По сравнению с другими генами MaGBBS этот локус характеризуется сдвигом рамки считывания и стоп-кодонами в первом экзоне. MaGBSSI-3 может быть главным образом ответственным за активность GBSS в банановых фруктах, поскольку он сильно экспрессируется в развивающихся крахмальных зернах и подавляется во время разложения крахмала. MaGBSSI-3 имеет 100% идентичность последовательности с фрагментом последовательности GBSS (номер доступа AAQ06271), полученным из кДНК SSH [23]. Локус MaGBSSI-3 содержит 6 экзонов и характеризуется 5 заменами аминокислот (T → S, F → M, P → F, C → Q, G → N) в блоке 2 (рис. S1 и рис. S2. ). Этот ген не обнаружен у других видов. У яблока три гена, кодирующие GBSS, обозначенные как MdGBSSII-1 , MdGBSSII-2 и MdGBSSII-3 , содержат 13, 12 и 13 экзонов соответственно. Каждый из персикового PpGBSSII-1 и PpGBSSII-2 содержит 13 экзонов; оранжевый CsGBSSII-1 и CsGBSSII-2 состоят из 12 и 13 экзонов соответственно [1]. GBSSI гены риса (AF141955), кукурузы (NM001111531), пшеницы (AB019624) и ячменя (SBU23945) содержат 13, 13, 11 и 11 экзонов соответственно. Эти результаты предполагают, что MaGBSSI может быть специфическим геном бананового плода.

Гены, кодирующие пшеницу GBSSI членов семейства расположены на хромосомах 7AS, 7DS и 4AL [24].Гены пшеницы GBSSII расположены на хромосомах 2B, 2D и на длинном плече хромосомы 2A [11]. В этом исследовании MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 и MaGBSSI-3 были обнаружены на хромосоме 1 банана, а MaGBSSI-4 находится на хромосоме 9. Гены, кодирующие банан MaGBSSII-1, и MaGBSSII. -2 расположены на хромосомах 4 и 8 соответственно (рис. S1). Таким образом, локализация генов MaGBSSI и MaGBSSII в разных хромосомах предполагает, что MaGBSSI и MaGBSSII кодируются отдельными генами.

Экспрессия

генов GBSS в тканях банана

Ген пшеницы GBSSI экспрессируется исключительно в репродуктивных тканях, таких как эндосперм, эмбрионы и пыльца, в то время как ген GBSSII экспрессируется в тканях, не обладающих запасами, включая лист, стебель, корень и околоплодник [11]. У эвдикотов генов GBSS , идентифицированных в яблоках, персиках и апельсинах, экспрессируются как в вегетативных, так и в репродуктивных тканях, таких как листья, цветы и плоды [1]. GBSSI в Amaranthus cruentus экспрессируется в органах, не связанных с хранением, таких как лист, стебель, черешок и корень [10]. Ген гороха GBSSI экспрессируется в листьях, стручках, корнях и зародышах, но не в цветках или прилистниках [25]. В нашем исследовании экспрессия MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 и MaGBSSI-4 была повышена в вегетативных органах, таких как корень, стебель, лист и прицветник (рис.4). Паттерн экспрессии подобен генам GBSSI у других эвдикотов [10], [25]. Ген банана MaGBSSI-3 обильно экспрессировался в репродуктивных тканях, таких как цветок, кожура и мякоть, в то время как гены MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 были высоко экспрессированы в вегетативных органах, таких как корень, стебель, лист. и прицветник (рис.4). Паттерн экспрессии GBSS больше похож на гены GBSSI и GBSSII у однодольных [11]. Эти результаты предполагают, что накопление амилозы в вегетативных органах банана может коррелировать с обильной экспрессией MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 в корне, стебле. , лист и прицветник (рис.4). Однако накопление амилозы в репродуктивных органах банана может потребовать активности MaGBSSI-3 в цветках, кожуре и мякоти (рис. 4).

Экспрессия

генов GBSS на разных стадиях развития плодов банана

У Amaranthus cruentus GBSSI сильно экспрессировался на средней и средне-поздней стадиях развития семян и после этого снижался [10]. GBSSI-1 Экспрессия в эндосперме пшеницы может контролировать синтез крахмала на посттранскрипционном уровне [5].В плодах яблони генов GBSSII высоко экспрессируются на всех стадиях развития. Ген GBSSII-2 у персика экспрессируется только во время раннего развития плода, а ген GBSSII-2 у апельсина слабо экспрессируется во время развития плода [1]. Шесть генов GBSS в нашем исследовании можно разделить на две группы в соответствии с их временными паттернами экспрессии. Гены с ранней экспрессией ( MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 ) экспрессируются на ранней стадии (0-30 дней) образование гранул крахмала и аналогичны гену GBSSII-2 в плодах персика [1].Уровень экспрессии MaGBSSI-1 и MaGBSSI-2 на ранних стадиях развития плодов банана был примерно в 5 раз выше, чем у MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 . Этот результат предполагает, что MaGBSSI-1 и MaGBSSI-2 могут играть важную роль в раннем накоплении крахмала в плодах банана. Вторая группа состоит из одного гена с поздней экспрессией ( MaGBSSI-3 ), который экспрессируется на более поздней стадии (30–60 дней) образования крахмальных гранул во время развития плода банана (рис.5А). Эти данные свидетельствуют о том, что шесть генов MaGBSS , клонированных из плодов банана, способствуют накоплению крахмала на разных стадиях развития и на разных уровнях.

MaGBSSI-3 может участвовать в регулировании количества и размера гранул крахмала в банановых фруктах

У мутантов злаков, разветвляющие ферменты (в основном изоамилазы) влияют на количество и форму гранул [26]. Buleon et al. [27] сообщили, что в клетках GBSS-дефектного (sta2) мутанта Chlamydomonas reinhardtii гранулы крахмала меньше (0.19–15 часов) и имеют более правильную форму. В клубнях картофеля активность SSIII также изменяет форму гранул [14]. Slack и Wainwright [18] сообщили, что маленькие гранулы возникают на ранней стадии развития в незрелой ткани, тогда как большие гранулы обнаруживаются в зрелой ткани во время развития ячменного зерна. Однако о влиянии активности GBSS на гранулы крахмала в плодах банана еще не сообщалось. В этом исследовании анализ с помощью сканирующей электронной микроскопии показал, что это изменение количества и размера гранул крахмала согласуется с паттерном экспрессии MaGBSSI-3 во время развития плодов банана (рис.6), предполагая, что MaGBSSI-3 может регулировать количество и размер гранул крахмала в плодах банана.

В заключение, содержание амилозы, активность фермента GBSS и уровни белка GBSS постепенно увеличивались во время развития плодов банана, но они снижались во время хранения плодов банана. Полноразмерные кДНК, кодирующие MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-3 , MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 были 1851 бит / с, 1851 бит / с , 1845 п. н., 2265 п.н. и 906 п.н. соответственно.Среди шести генов MaGBSS только MaGBSSI-3 высоко экспрессировался в репродуктивных тканях и на поздних стадиях развития плодов банана. Анализ с помощью сканирующей электронной микроскопии показал, что уровень экспрессии MaGBSSI-3 коррелирует с количеством и размером гранул крахмала в плоде банана во время развития и хранения. Эти результаты предполагают, что повышенная экспрессия MaGBSSI-3 может быть ключевым фактором, регулирующим метаболизм амилозы, влияя на вариацию уровней GBSS, а также количества и размера гранул крахмала в плодах банана.Необходима дальнейшая работа для выяснения того, как разные уровни экспрессии гена MaGBSSI-3 в разное время могут приводить к изменениям качества и размера крахмальных гранул плодов банана.

Материалы и методы

Растительные материалы

Плоды

банана ( M. acuminata L. AAA group сорт Brazilian) были получены с банановой плантации Института тропической биологии и биотехнологии (Чэнмай, провинция Хайнань, Китай). Ткани корня, стебля, листа, прицветника, цветка, кожуры и мякоти собирали отдельно с помощью пинцета и немедленно замораживали в жидком азоте, а затем хранили при -80 ° C до дальнейшего анализа. Пульпы 0 дней, 10 дней, 20 дней, 30 дней, 40 дней, 50 дней и 60 дней после выхода из псевдостебля собирали, немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C для анализа экспрессии.

Банановые руки были разделены на отдельные пальцы, представляющие одну и ту же стадию развития. Группу банановых пальчиков держали при 22 ° C и позволяли естественным образом созреть.В соответствии со стадиями созревания бананов [28] плоды инкубировали в течение 0 дней, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней, 25 дней и 30 дней после сбора урожая, затем замораживали в жидком азоте и хранили при -80. ° C до дальнейшего анализа. Все эксперименты повторяли трижды.

Определение общего содержания крахмала, содержания амилозы и активности фермента GBSS

Мякоть банана погружали в 0,5% раствор бисульфита натрия на 10 мин, чтобы предотвратить потемнение, а затем сушили при 40 ° C в течение 24 часов. Мякоть измельчали ​​и центрифугировали.Остаток суспендировали в 5 мл 80% Ca (NO ₃ ) ₂ на кипящей водяной бане в течение 10 минут, а затем центрифугировали в течение 4 минут при 4000 об / мин. Супернатант переносили в мерную колбу на 20 мл, и остаток дважды экстрагировали 80% Ca (NO ₃ ) ₂ , получая объединенный объем экстракта 20 мл. Все эксперименты повторяли трижды. Общее содержание крахмала определяли по методу Yang et al. [29].

13 мг крахмала помещали в градуированную пробирку с крышкой на 10 мл, в которую добавляли 1.0 мл 1М раствора NaOH. Содержание амилозы в мякоти банана определяли по методу, описанному Yang et al. [29]. Активность GBSS определяли по методике Nakamura et al. [24].

Определение уровней белка GBSS с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга

Гранулы крахмала очищали из 0,5 г банановой мякоти каждого образца в соответствии с методом Nakamura et al. [24] с некоторыми изменениями. Образец очищенного крахмала 10 мг суспендировали в буфере для образцов (0. 5 M трис-HCL pH 6,8, 2,5% SDS, 10% глицерин, 2% 2-меркаптоэтанол) и кипятили в течение 3 минут, затем центрифугировали при 15000 об / мин в течение 5 минут. Супернатант подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) с использованием 12% разделяющего геля и 5% пакетирующего геля. Гели окрашивали кумасси синим и обесцвечивали согласно стандартным протоколам.

образцов белка GBSS смешивали с буфером для образцов SDS-PAGE, кипятили 5 мин и разделяли на 12% полиакриламидных гелях. Белки переносили на мембраны Hybond ™ –N ⁺ (Amersham Biosciences, Бакингемшир, Великобритания) для вестерн-блоттинга.Мембраны зондировали кроличьими поликлональными антителами против GBSS (Abmart, Шанхай, Китай), разведенными 1-1000 в PBS-Tween 20 (PBST) плюс 3% BSA, с последующим введением конъюгированных с щелочной фосфатазой (AP) вторичных антител против кроличьих IgG ( Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) разбавлен на 11000. Положительные сигналы на мембранах регистрировали раствором 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат / нитросиний тетразолий (BCIP / NBT) (Amresco, США).

Выделение тотальной РНК и синтез двухцепочечной кДНК

Суммарную РНК

экстрагировали из различных тканей с помощью набора RNAout для растений (TIANDZ, Пекин, Китай).Целостность и концентрацию выделенных РНК исследовали с помощью электрофореза в агарозном геле и спектрофотометрии (GelDoc-XR, Bio-RAD, Hercules, Калифорния, США). КДНК первой цепи синтезировали в 20,0 мкл реакционной смеси с использованием 1,0 мкг общей РНК, праймера Oligo (dT) ₁₈ и набора для обратной транскриптазы M-MLV в соответствии с инструкциями производителя (TaKaRa, Далянь, Китай).

Клонирование шести генов

GBSS в банановых фруктах

гомолога GBSS в банане были идентифицированы с использованием метода на основе BLAST.Пары праймеров были разработаны для амплификации каждого гена, и их последовательности представлены в таблице S1. Программа ПЦР состояла из 35 циклов по 40 с при 94 ° C, 40 с при 58 ° C, 90 с при 72 ° C и заключительное продление в течение 10 мин при 72 ° C.

продуктов ПЦР очищали с использованием набора для очистки ДНК в агарозном геле (TaKaRa, Далянь, Китай) и вставляли в вектор pMD19-T (TaKaRa, Далянь, Китай). Лигированные продукты трансформировали в компетентных клеток E. coli DH5α. Положительные рекомбинантные плазмиды отбирали методом отбора «белый / синий» и проверяли с помощью ПЦР колоний.Затем ДНК-мишень подтверждали расщеплением рестрикционным ферментом и определением последовательности. Полноразмерные последовательности кДНК, кодирующие MaGBSSI-1 , MaGBSSI-2 , MaGBSSI-3 , MaGBSSI-4 , MaGBSSII-1 и MaGBSSII-2 , были представлены в GenBank.

Анализ последовательности

Banana Кодирующие последовательности GBSS были обработаны методом BLAST в базе данных последовательностей генома банана (http://banana-genome.cirad.fr/) для восстановления соответствующих последовательностей геномной ДНК.Длины экзонов рассчитывали путем выравнивания последовательностей геномной ДНК с последовательностями кДНК, а интроны определяли в соответствии с правилом «GC-AG» [1].

Сходство полноразмерных последовательностей кДНК банана GBSSI или GBSSII с другими гомологами в базе данных GenBank было выполнено с помощью программы BLAST ( E <0,001). Выведенные аминокислотные последовательности были выровнены с использованием компьютерной программы Clustal W, и дерево гомологии было построено методом объединения соседей с использованием программного обеспечения MEGA (Университет штата Аризона, Темпе, Аризона, США).Число для каждой внутренней ветви - это процентное значение начальной загрузки, рассчитанное на основе 1000 реплик.

Профили экспрессии шести генов

GBSS в банане с использованием количественной ПЦР с обратной транскрипцией (Q-RTPCR)

Конкретные пары праймеров были сконструированы с использованием программного обеспечения Primer 5.0, и их последовательности перечислены в таблице S1. Уровни экспрессии генов GBSS были количественно определены с помощью Q-RTPCR с использованием системы обнаружения ПЦР в реальном времени iQ5 (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, США) и набора SYBR Ex Script RT-PCR (TaKaRa, Далянь, Китай). ).Каждая реакция объемом 25,0 мкл содержала 12,5 мкл SYBR® Premix Ex Taq ™ (TaKaRa, Далянь, Китай), 1,0 мкл каждого праймера (5,0 мкМ), 8,5 мкл ddH ₂ O и 2,0 мкл кДНК (40 нг). . Ген актина (номер доступа EF672732) использовали в качестве внутреннего эталонного контроля.

Программа амплификации состояла из одного цикла при 95 ° C в течение 1 мин, за которым следовали 40 циклов при 95 ° C в течение 10 с, 57 ° C в течение 15 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд. Анализ кривой плавления проводили в конце 40 циклов, чтобы гарантировать правильную амплификацию целевых фрагментов.Показания флуоресценции собирали от 60 ° C до 90 ° C при скорости нагрева 0,5 ° C с ^-1 для анализа кривой плавления. Реакционные смеси без матриц кДНК использовали в качестве отрицательного контроля, чтобы исключить загрязнение ДНК. Все анализы повторяли трижды с использованием биологических повторов. Относительные уровни экспрессии каждого гена рассчитывали с использованием метода 2 ^{— ΔΔ C T} [30]. Данные анализировали с помощью программного обеспечения iQ5, поставляемого с системой обнаружения ПЦР в реальном времени iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

На основе экспрессии генов GBSS на разных стадиях развития и хранения плодов банана мякоть была выделена через 0, 30 и 60 дней развития, а из плодов через 0, 5 и 10 дней. место хранения.

Образцы фиксировали в отрезках с помощью двусторонней ленты и покрывали слоем платины толщиной 10 нм в системе покрытия Bal-tec MEDo020 (Kettleshulme, Великобритания). Образцы анализировали на сканирующем электронном микроскопе FEI Quanta 600 FEG (FEI Company, Орегон, США).СЭМ-наблюдения проводились в режиме вторичных электронов при 15 кВ.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Мотивы последовательностей и хромосомная локализация шести генов, кодирующих GBSS в банане. А. Структурная организация генов банана GBSS . Сплошные прямоугольники обозначают экзоны, жирные линии обозначают интроны. B, Хромосомная локализация генов банана GBSS .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088077.s001

(TIF)

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: HXM BYX ZQJ. Проведены эксперименты: HXM PGS WXL. Проанализированы данные: HXM PGS. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: HXM BYX ZQJ. Написал статью: HXM PGS. Анализ последовательности: HXM PGS.

Ссылки

1. 1. Ченг Дж., Хан М.А., Цю В.М., Ли Дж., Чжоу Х. и др. (2012) Диверсификация генов, кодирующих синтазу связанного с гранулами крахмала в однодольных и двудольных, отмечена множественными событиями дупликации по всему геному.PloS One doi10.1371 / журнал. pone.003 0088.
2. 2. Juansang J, Puttanlek C, Rungsardthong V, Puncha-arnon S, Uttapap D (2012) Влияние желатинизации на медленно усваиваемый крахмал и устойчивый крахмал термовлажностойких и химически модифицированных крахмалов канны. Food Chem 131: 500–507.
3. 3. Лю Дж, Вэнь И, Донг Н., Лай С., Чжао Г. (2013) Аутентификация порошка корня лотоса, фальсифицированного картофельным крахмалом и / или сладким картофельным крахмалом, с использованием спектроскопии с преобразованием Фурье в среднем инфракрасном диапазоне.Food Chem 141: 3103–3109.
4. 4. Zeeman SC, Kossmann J, Smith AM (2010) Крахмал: его метаболизм, эволюция и биотехнологическая модификация в растениях. Анну Рев Плант Биол 61: 209–234.
5. 5. Wang ZB, Li WH, Qi JC, Shi PC, Yin YG (2011) Накопление крахмала, активность ключевого фермента и экспрессия генов в синтезе крахмала эндосперма пшеницы с различным содержанием крахмала. J Food Sci Tech doi10.1007 / s 13197-011-0520-z.
6. 6. Отани М., Хамада Т., Катаяма К., Китахара К., Ким С.Х. и др.(2007) Ингибирование экспрессии гена гранулированной синтазы крахмала I посредством РНК-интерференции в растениях сладкого картофеля. Rep клетки растений 26: 1801–1807.
7. 7. Уильямс П.Н., Вильяда А., Дикон С., Рааб А., Фигуэрола Дж. И др. (2007) Значительно усиленная ассимиляция мышьяка в рисе приводит к более высоким уровням в зерне по сравнению с пшеницей и ячменем. Environ Sci Technol 41: 6854–6859.
8. 8. Kimura T, Saito A (2010) Неоднородность сайтов поли (A) в гене гранулированной синтазы крахмала I в сладком картофеле ( Ipomoea batatas (L.) Лам.). Biosci Biotech Bioch 74: 667–669.
9. 9. Zou W, Yu L, Liu XX, Chen L, Zhang XQ и др. (2012) Влияние соотношения амилоза / амилопектин на супервпитывающие полимеры на основе крахмала. Carbohyd Polym 87: 1583–1588.
10. 10. Пак Й.Дж., Немото К., Нисикава Т., Мацусима К., Минами М. и др. (2009) Молекулярное клонирование и характеристика кДНК синтазы I, связанной с гранулами, из зернового амаранта ( Amaranthus cruentus L.). Breeding Sci 59: 351–360.
11. 11.Vrinten PL, Nakamura T (2000) Синтазы I и II крахмала, связанные с гранулами пшеницы, кодируются отдельными генами, которые экспрессируются в разных тканях. Физиология растений 122: 1255–264.
12. 12. Хуарес-Гарсия Э., Агама-Асеведо Э., Гомес-Монтиель Н.О., Роблес В.П., Белло-Пе-Рез Л.А. (2013) Протеомный анализ ферментов, участвующих в биосинтезе крахмала кукурузы с различным типом эндосперма и характеристиками крахмала. J Sci Food Agr 93: 2660–2668.
13. 13. Минакшисундарам П., Патель С.Б., Судха М., Гитанджали С., Винод К.К. и др.(2011) Построение карты сцепления на основе микросателлитных маркеров и картирование гранулированной синтазы крахмала (GBSS) в обогащенных рекомбинантных инбредных линиях скрещивания Basmati370 / ASD16. Урожай Improv 38: 155–162.
14. 14. Эдвардс А., Винкен Дж. П., Суурс LCJM, Виссер RGF, Зееман С. и др. (2002) Дискретные формы амилозы синтезируются изоформами GBSSI в горохе. Растительная клетка 14: 1767–1785.
15. 15. Bansal A, Kumari V, Taneja D, Sayal R, Das N (2012) Молекулярное клонирование и характеристика аллелей связанной с гранулами крахмал-синтазы I (GBSSI) из картофеля и анализ последовательности для обнаружения цис-регулирующих мотивов . Тканевый орган растительной клетки 109: 247–261.
16. 16. D’Hont A, Denoeud F, Aury J, Baurens F, Carreel F и др. (2012) Геном банана ( Musa acuminata ) и эволюция однодольных растений. Природа 488: 213–217.
17. 17. Aparicio-Saguilan A, Díaz P, Agama-Acevedo E, Islas-Hernández JJ, Bello-Perez LA (2013) Тортилла с добавлением незрелых бананов и муки из маниоки: химический состав и усвояемость крахмала. CyTA — J Food 11: 90–95.
18. 18. Slack PT, Wainwright T (1980) Амилолиз больших гранул крахмала из ячменя в зависимости от их температур желатинизации. J I Brewing 86: 74–77.
19. 19. Цзян Х., Чжан Дж., Ван Дж., Ся М., Чжу С. и др. (2013) Опосредованное РНК-интерференцией подавление гена фермента ветвления крахмала улучшает содержание амилозы в рисе. Genet Mol Res doi http://dx.doi.org/10.4238/2013.
20. 20. Кришнан Х. Б., Чен М. (2013) Идентификация обильного белка 56 кДа, связанного с пищевой аллергией, как связанная с гранулами синтаза крахмала. J Agr Food Chem 61: 5404–5409.
21. 21. Shure M, Wessler S, Fedoroff N (1983) Молекулярная идентификация и изоляция воскового локуса кукурузы. Ячейка 35: 225–233.
22. 22. Ko Y T, Dong YL, Hsieh YF, Kuo JC (2009) Морфология, анализ ассоциированного белка и идентификация крахмал-синтазы 58 кДа в препаратах крахмальных гранул маша ( Vigna radiate L. cv. KPS1). J Agr Food Chem 57: 4426–4432.
23. 23. Xu BY, Su W, Liu JH, Wang JB, Jin ZQ (2007) Дифференциально экспрессируемые кДНК на ранней стадии созревания бананов, идентифицированные с помощью супрессивной субтрактивной гибридизации и микроматрицы кДНК.Planta 226: 529–539.
24. 24. Накамура Т., Вринтен П., Хаякава К., Икеда Дж. (1998) Характеристика связанной с гранулами изоформы синтазы крахмала, обнаруженной в околоплоднике пшеницы. Физиология растений 118: 451–459.
25. 25. Драй I, Смит А., Эдвардс А., Бхаттачаррия М., Данн П. и др. (1992) Характеристика кДНК, кодирующих две изоформы синтазы связанного с гранулами крахмала, которые демонстрируют дифференциальную экспрессию в развивающихся органах хранения гороха и картофеля. Завод J 2: 193–202.
26. 26. Jobling S (2004) Улучшение крахмала для пищевых и промышленных применений. Curr Opin Plant Biol 7: 210–218.
27. 27. Булеон А., Галант Диджей, Муилл Дж., Д’Халст С., Коссманн Дж. И др. (1997) Крахмалы от A до C (chlamydomonas reinhardtii как модельная микробная система для исследования биосинтеза кристаллов амилопектина растений). Физиология растений 115: 949–957.
28. 28. Стовер Р. Х., Симмондс Н. М. (1987) Бананы. Лондон: Longman> Наука и технологии192–193.
29. 29. Ян Дж. Х., Би К. Г., Сонг В. К. (1992) Метод половинного зерна для анализа содержания амилозы в зернах риса и его применение. Acta Agronomica Sinica 18: 366–372.
30. 30. Ливак К.Дж., Шимиттген Т.Д. (2001) Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2 ^-ΔΔCT . Методы 25: 402–408.

% PDF-1. 5 % 4 0 obj > endobj 7 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000I \ 000n \ 000t \ 000r \ 000o \ 000d \ 000u \ 000c \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040) endobj 8 0 объект > endobj 11 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000M \ 000a \ 000t \ 000e \ 000r \ 000i \ 000a \ 000l \ 000s \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000M \ 000e \ 000t \ 000h \ 000o \ 000d \ 000с \ 000 \ 040) endobj 12 0 объект > endobj 15 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000P \ 000l \ 000a \ 000n \ 000t \ 000 \ 040 \ 000M \ 000a \ 000t \ 000e \ 000r \ 000i \ 000a \ 000l \ 000s \ 000 \ 040) endobj 16 0 объект > endobj 19 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000S \ 000a \ 000m \ 000p \ 000l \ 000e \ 000 \ 040 \ 000P \ 000r \ 000e \ 000p \ 000a \ 000r \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000D \ 000N \ 000A \ 000 \ 040 \ 000E \ 000x \ 000t \ 000r \ 000a \ 000c \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040) endobj 20 0 объект > endobj 23 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000t \ 000i \ 000c \ 000 \ 040 \ 000D \ 000i \ 000v \ 000e \ 000r \ 000s \ 000i \ 000t \ 000y \ 000 \ 040 \ 000A \ 000n \ 000a \ 000l \ 000y \ 000s \ 000i \ 000s \ 000, \ 000 \ 040 \ 000P \ 000o \ 000p \ 000u \ 000l \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000S \ 000t \ 000r \ 000u \ 000c \ 000t \ 000u \ 000r \ 000e \ 000 \ 040 \ 000A \ 000n \ 000a \ 000l \ 000y \ 000s \ 000i \ 000s \ 000, \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000S \ 000t \ 000a \ 000r \ 000c \ 000h \ 000 \ 040 \ 000P \ 000r \ 000o \ 000p \ 000e \ 000r \ 000t \ 000i \ 000e \ 000s \ 000 \ 040 \ 000E \ 000v \ 000a \ 000l \ 000u \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040) endobj 24 0 объект > endobj 27 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000C \ 000a \ 000n \ 000d \ 000i \ 000d \ 000a \ 000t \ 000e \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000 \ 040 \ 000S \ 000e \ 000l \ 000e \ 000c \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040) endobj 28 0 объект > endobj 31 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000S \ 000e \ 000q \ 000u \ 000e \ 000n \ 000c \ 000e \ 000 \ 040 \ 000A \ 000n \ 000a \ 000l \ 000y \ 000s \ 000i \ 000s \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000P \ 000r \ 000i \ 000m \ 000e \ 000r \ 000 \ 040 \ 000D \ 000e \ 000s \ 000i \ 000g \ 000n \ 000 \ 040) endobj 32 0 объект > endobj 35 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000 \ 040 \ 000C \ 000l \ 000o \ 000n \ 000i \ 000n \ 000g \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000R \ 000e \ 000f \ 000e \ 000r \ 000e \ 000n \ 000c \ 000e \ 000 \ 040 \ 000S \ 000e \ 000q \ 000u \ 000e \ 000n \ 000c \ 000e \ 000 \ 040 \ 000D \ 000e \ 000t \ 000e \ 000r \ 000m \ 000i \ 000n \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040) endobj 36 0 объект > endobj 39 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000D \ 000N \ 000A \ 000 \ 040 \ 000E \ 000q \ 000u \ 000i \ 000v \ 000a \ 000l \ 000e \ 000n \ 000t \ 000 \ 040 \ 000P \ 000o \ 000o \ 000l \ 000i \ 000n \ 000g \ 000 \ 040) endobj 40 0 obj > endobj 43 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000A \ 000m \ 000p \ 000l \ 000i \ 000c \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000S \ 000e \ 000q \ 000u \ 000e \ 000n \ 000c \ 000i \ 000n \ 000g \ 000 \ 040) endobj 44 0 объект > endobj 47 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000o \ 000t \ 000y \ 000p \ 000e \ 000 \ 040 \ 000C \ 000a \ 000l \ 000l \ 000i \ 000n \ 000g \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000V \ 000a \ 000r \ 000i \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000F \ 000i \ 000l \ 000t \ 000e \ 000r \ 000i \ 000n \ 000g \ 000 \ 040) endobj 48 0 объект > endobj 51 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000T \ 000o \ 000t \ 000a \ 000l \ 000 \ 040 \ 000P \ 000o \ 000l \ 000y \ 000m \ 000o \ 000r \ 000p \ 000h \ 000i \ 000s \ 000m \ 000 \ 040 \ 000R \ 000a \ 000t \ 000e \ 000 \ 040 \ 000C \ 000a \ 000l \ 000c \ 000u \ 000l \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000N \ 000o \ 000n \ 000- \ 000S \ 000y \ 000n \ 000o \ 000n \ 000y \ 000m \ 000o \ 000u \ 000s \ 000 \ 040 \ 000S \ 000N \ 000P \ 000 \ 040 \ 000 \ 050 \ 000n \ 000s \ 000S \ 000N \ 000P \ 000 \ 051 \ 000 \ 040 \ 000D \ 000e \ 000t \ 000e \ 000c \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040) endobj 52 0 объект > endobj 55 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000M \ 000a \ 000r \ 000k \ 000e \ 000r \ 000 \ 040 \ 000D \ 000e \ 000v \ 000e \ 000l \ 000o \ 000p \ 000m \ 000e \ 000n \ 000t \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000I \ 000d \ 000e \ 000n \ 000t \ 000i \ 000f \ 000i \ 000c \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040) endobj 56 0 объект > endobj 59 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000I \ 000L \ 000P \ 000 \ 040 \ 000M \ 000a \ 000r \ 000k \ 000e \ 000r \ 000 \ 040 \ 000D \ 000e \ 000v \ 000e \ 000l \ 000o \ 000p \ 000m \ 000e \ 000n \ 000t \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000I \ 000d \ 000e \ 000n \ 000t \ 000i \ 000f \ 000i \ 000c \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040) endobj 60 0 obj > endobj 63 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000R \ 000e \ 000s \ 000u \ 000l \ 000t \ 000s \ 000 \ 040) endobj 64 0 объект > endobj 67 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000T \ 000h \ 000e \ 000 \ 040 \ 000S \ 000w \ 000e \ 000e \ 000t \ 000 \ 040 \ 000P \ 000o \ 000t \ 000a \ 000t \ 000o \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000r \ 000m \ 000p \ 000l \ 000a \ 000s \ 000m \ 000s \ 000 \ 040 \ 000E \ 000x \ 000h \ 000i \ 000b \ 000i \ 000t \ 000e \ 000d \ 000 \ 040 \ 000H \ 000i \ 000g \ 000h \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000t \ 000i \ 000c \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000P \ 000h \ 000e \ 000n \ 000o \ 000t \ 000y \ 000p \ 000i \ 000c \ 000 \ 040 \ 000D \ 000i \ 000v \ 000e \ 000r \ 000s \ 000i \ 000t \ 000y \ 000 \ 040) endobj 68 0 объект > endobj 71 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000T \ 000w \ 000e \ 000n \ 000t \ 000y \ 000 \ 040 \ 000C \ 000a \ 000n \ 000d \ 000i \ 000d \ 000a \ 000t \ 000e \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000s \ 000 \ 040 \ 000W \ 000e \ 000r \ 000e \ 000 \ 040 \ 000C \ 000a \ 000p \ 000t \ 000u \ 000r \ 000e \ 000d \ 000 \ 040 \ 000f \ 000o \ 000r \ 000 \ 040 \ 000V \ 000a \ 000r \ 000i \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000D \ 000e \ 000t \ 000e \ 000c \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040) endobj 72 0 объект > endobj 75 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000N \ 000u \ 000m \ 000b \ 000e \ 000r \ 000 \ 040 \ 000o \ 000f \ 000 \ 040 \ 000R \ 000e \ 000a \ 000d \ 000s \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000A \ 000v \ 000e \ 000r \ 000a \ 000g \ 000e \ 000 \ 040 \ 000C \ 000o \ 000v \ 000e \ 000r \ 000a \ 000g \ 000e \ 000 \ 040 \ 000O \ 000b \ 000t \ 000a \ 000i \ 000n \ 000e \ 000d \ 000 \ 040 \ 000f \ 000r \ 000o \ 000m \ 000 \ 040 \ 000N \ 000G \ 000S \ 000 \ 040) endobj 76 0 объект > endobj 79 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000D \ 000e \ 000t \ 000e \ 000c \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000o \ 000f \ 000 \ 040 \ 000S \ 000N \ 000P \ 000s \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000I \ 000n \ 000D \ 000e \ 000l \ 000s \ 000 \ 040) endobj 80 0 объект > endobj 83 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000N \ 000o \ 000n \ 000- \ 000S \ 000y \ 000n \ 000o \ 000n \ 000y \ 000m \ 000o \ 000u \ 000s \ 000 \ 040 \ 000S \ 000u \ 000b \ 000s \ 000t \ 000i \ 000t \ 000u \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000s \ 000 \ 040 \ 000w \ 000e \ 000r \ 000e \ 000 \ 040 \ 000I \ 000d \ 000e \ 000n \ 000t \ 000i \ 000f \ 000i \ 000e \ 000d \ 000 \ 040 \ 000i \ 000n \ 000 \ 040 \ 000S \ 000t \ 000a \ 000r \ 000c \ 000h \ 000 \ 040 \ 000B \ 000i \ 000o \ 000s \ 000y \ 000n \ 000t \ 000h \ 000e \ 000s \ 000i \ 000s \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000M \ 000e \ 000t \ 000a \ 000b \ 000o \ 000l \ 000i \ 000s \ 000m \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000s \ 000 \ 040) endobj 84 0 объект > endobj 87 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000D \ 000e \ 000v \ 000e \ 000l \ 000o \ 000p \ 000m \ 000e \ 000n \ 000t \ 000 \ 040 \ 000o \ 000f \ 000 \ 040 \ 000C \ 000A \ 000P \ 000S \ 000 \ 040 \ 000M \ 000a \ 000r \ 000k \ 000e \ 000r \ 000s \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000V \ 000e \ 000r \ 000i \ 000f \ 000i \ 000c \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000o \ 000f \ 000 \ 040 \ 000S \ 000N \ 000P \ 000s \ 000 \ 040) endobj 88 0 объект > endobj 91 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000F \ 000r \ 000a \ 000m \ 000e \ 000s \ 000h \ 000i \ 000f \ 000t \ 000 \ 040 \ 000I \ 000n \ 000D \ 000e \ 000l \ 000s \ 000 \ 040 \ 000w \ 000e \ 000r \ 000e \ 000 \ 040 \ 000D \ 000e \ 000t \ 000e \ 000c \ 000t \ 000e \ 000d \ 000 \ 040) endobj 92 0 объект > endobj 95 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000T \ 000w \ 000o \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000 \ 040 \ 000F \ 000o \ 000r \ 000m \ 000s \ 000 \ 040 \ 000w \ 000e \ 000r \ 000e \ 000 \ 040 \ 000D \ 000e \ 000t \ 000e \ 000c \ 000t \ 000e \ 000d \ 000 \ 040 \ 000i \ 000n \ 000 \ 040 \ 000I \ 000b \ 000A \ 000G \ 000P \ 000b \ 0003 \ 000 \ 040) endobj 96 0 объект > endobj 99 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000I \ 000n \ 000t \ 000r \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000L \ 000o \ 000s \ 000s \ 000 \ 040 \ 000i \ 000n \ 000 \ 040 \ 000t \ 000h \ 000e \ 000 \ 040 \ 000I \ 000b \ 000G \ 000B \ 000S \ 000S \ 0001 \ 000- \ 0001 \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000s \ 000 \ 040) endobj 100 0 объект > endobj 103 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000D \ 000i \ 000s \ 000c \ 000u \ 000s \ 000s \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040) endobj 104 0 объект > endobj 107 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000E \ 000f \ 000f \ 000e \ 000c \ 000t \ 000i \ 000v \ 000e \ 000 \ 040 \ 000S \ 000t \ 000r \ 000a \ 000t \ 000e \ 000g \ 000i \ 000e \ 000s \ 000 \ 040 \ 000f \ 000o \ 000r \ 000 \ 040 \ 000C \ 000a \ 000p \ 000t \ 000u \ 000r \ 000i \ 000n \ 000g \ 000 \ 040 \ 000a \ 000n \ 000d \ 000 \ 040 \ 000I \ 000d \ 000e \ 000n \ 000t \ 000i \ 000f \ 000y \ 000i \ 000n \ 000g \ 000 \ 040 \ 000A \ 000l \ 000l \ 000e \ 000l \ 000i \ 000c \ 000 \ 040 \ 000V \ 000a \ 000r \ 000i \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000s \ 000 \ 040 \ 000i \ 000n \ 000 \ 040 \ 000H \ 000e \ 000x \ 000a \ 000p \ 000l \ 000o \ 000i \ 000d \ 000 \ 040 \ 000S \ 000w \ 000e \ 000e \ 000t \ 000 \ 040 \ 000P \ 000o \ 000t \ 000a \ 000t \ 000o \ 000 \ 040) endobj 108 0 объект > endobj 111 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000C \ 000h \ 000a \ 000r \ 000a \ 000c \ 000t \ 000e \ 000r \ 000i \ 000s \ 000t \ 000i \ 000c \ 000s \ 000 \ 040 \ 000o \ 000f \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000 \ 040 \ 000S \ 000e \ 000q \ 000u \ 000e \ 000n \ 000c \ 000e \ 000 \ 040 \ 000V \ 000a \ 000r \ 000i \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000i \ 000n \ 000 \ 040 \ 000T \ 000a \ 000r \ 000g \ 000e \ 000t \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000s \ 000 \ 040) endobj 112 0 объект > endobj 115 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000C \ 000A \ 000P \ 000S \ 000 \ 040 \ 000M \ 000a \ 000r \ 000k \ 000e \ 000r \ 000s \ 000 \ 040 \ 000a \ 000r \ 000e \ 000 \ 040 \ 000A \ 000n \ 000 \ 040 \ 000E \ 000f \ 000f \ 000e \ 000c \ 000t \ 000i \ 000v \ 000e \ 000 \ 040 \ 000T \ 000o \ 000o \ 000l \ 000 \ 040 \ 000f \ 000o \ 000r \ 000 \ 040 \ 000S \ 000N \ 000P \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000o \ 000t \ 000y \ 000p \ 000i \ 000n \ 000g \ 000 \ 040 \ 000i \ 000n \ 000 \ 040 \ 000S \ 000w \ 000e \ 000e \ 000t \ 000 \ 040 \ 000P \ 000o \ 000t \ 000a \ 000t \ 000o \ 000 \ 040) endobj 116 0 объект > endobj 119 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000C \ 000r \ 000e \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000o \ 000f \ 000 \ 040 \ 000I \ 000n \ 000t \ 000r \ 000o \ 000n \ 000- \ 000L \ 000o \ 000s \ 000s \ 000 \ 040 \ 000A \ 000l \ 000l \ 000e \ 000l \ 000e \ 000s \ 000 \ 040 \ 000M \ 000i \ 000g \ 000h \ 000t \ 000 \ 040 \ 000B \ 000e \ 000 \ 040 \ 000a \ 000 \ 040 \ 000C \ 000h \ 000a \ 000r \ 000a \ 000c \ 000t \ 000e \ 000r \ 000i \ 000s \ 000t \ 000i \ 000c \ 000 \ 040 \ 000M \ 000e \ 000c \ 000h \ 000a \ 000n \ 000i \ 000s \ 000m \ 000 \ 040 \ 000o \ 000f \ 000 \ 040 \ 000R \ 000e \ 000g \ 000u \ 000l \ 000a \ 000t \ 000i \ 000n \ 000g \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000 \ 040 \ 000E \ 000x \ 000p \ 000r \ 000e \ 000s \ 000s \ 000i \ 000o \ 000n \ 000 \ 040 \ 000i \ 000n \ 000 \ 040 \ 000S \ 000w \ 000e \ 000e \ 000t \ 000 \ 040 \ 000P \ 000o \ 000t \ 000a \ 000t \ 000o \ 000 \ 040) endobj 120 0 объект > endobj 123 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000T \ 000h \ 000e \ 000 \ 040 \ 000I \ 000m \ 000p \ 000a \ 000c \ 000t \ 000 \ 040 \ 000o \ 000f \ 000 \ 040 \ 000G \ 000e \ 000n \ 000e \ 000t \ 000i \ 000c \ 000 \ 040 \ 000V \ 000a \ 000r \ 000i \ 000a \ 000t \ 000i \ 000o \ 000n \ 000s \ 000 \ 040 \ 000t \ 000o \ 000 \ 040 \ 000P \ 000h \ 000e \ 000n \ 000o \ 000t \ 000y \ 000p \ 000e \ 000 \ 040 \ 000i \ 000n \ 000 \ 040 \ 000A \ 000l \ 000l \ 000o \ 000h \ 000e \ 000x \ 000a \ 000p \ 000l \ 000o \ 000i \ 000d \ 000 \ 040 \ 000S \ 000w \ 000e \ 000e \ 000t \ 000 \ 040 \ 000P \ 000o \ 000t \ 000a \ 000t \ 000o \ 000 \ 040) endobj 124 0 объект > endobj 126 0 объект (\ 376 \ 377 \ 000R \ 000e \ 000f \ 000e \ 000r \ 000e \ 000n \ 000c \ 000e \ 000s) endobj 127 0 объект > endobj 145 0 объект > транслировать x ڵ r6_G! d ۮ ww ڴ Kl (RŪ {

Выделение и характеристика кДНК и геномных ДНК, кодирующих большие и малые субъединицы АДФ-глюкозопирофосфорилазы из сладкого картофеля

org/ScholarlyArticle»>

Ahn YO, Kim SH, Kim CY, Lee JS, Kwak SS, 2010 ) Использование экзогенной сахарозы и биосинтез крахмала среди сортов сладкого картофеля.Carbohydr Res 345: 55–60

CAS Статья PubMed Google ученый

Bae JM, Liu JR (1997) Молекулярное клонирование и характеристика двух новых изоформ малой субъединицы АДФ-глюкозопирофосфорилазы из сладкого картофеля. Mol Gen Genet 254: 179–185

CAS Статья PubMed Google ученый

Bahaji A, Li J, Ovecka M, Ezquer I, Muñoz FJ, Baroja-Fernández E, Romero JM, Almagro G, Montero M, Hidalgo M, Sesma MT, Pozueta-Romero J (2011) Arabidopsis thaliana мутанты, лишенные АДФ-глюкозопирофосфорилазы, накапливают крахмал и содержание АДФ-глюкозы дикого типа: еще одно доказательство наличия важных источников АДФ-глюкозы, связанных с биосинтезом крахмала в листьях, помимо АДФ-глюкозопирофосфорилазы. Физиология растительных клеток 52 (7): 1162–1176

CAS Статья PubMed Google ученый

Ballicora MA, Laughlin MJ, Fu YB, Okita TW, Barry GF, Preiss J (1995) Аденозин-5′-дифосфат-глюкозопирофосфорилаза из клубней картофеля. Значение N-конца малой субъединицы для каталитических свойств и термостабильности. Физиология растений 109: 245–251

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Ballicora MA, Iglesias AA, Preiss J (2004) АДФ-глюкозопирофосфорилаза: регуляторный фермент для синтеза растительного крахмала.Photosynth Res 79: 1–24

CAS. Статья PubMed Google ученый

org/ScholarlyArticle»>

Ballicora MA, Dubay JR, Devillers CH, Preiss J (2005) Возрождение предковой ферментативной роли модулирующей субъединицы. J Biol Chem 280: 10189–10195

CAS Статья PubMed Google ученый

Baris I, Tuncel A, Ozber N, Keskin O, Kavakli IH (2009) Исследование взаимодействия между большой и малой субъединицами АДФ-глюкозопирофосфорилазы картофеля.PLoS Comput Biol 5 (10): e1000546

Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Beckles DM, Craig J, Smith AM (2001) АДФ-глюкозопирофосфорилаза находится в пластиде развивающихся плодов томата. Физиология растений 126 (1): 261–266

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

org/ScholarlyArticle»>

Chen Y, Zhou F, Li G, Xu Y (2009) ОБЯЗАТЕЛЬНО: система для идентификации миниатюрных перевернутых транспонированных элементов и приложений для Anabaena variabilis и Haloquadratum walsbyi .Ген 436: 1–7

CAS Статья PubMed Google ученый

Crevillén P, Ballicora MA, Mérida A, Preiss J, Romero JM (2003) Различные изоформы больших субъединиц Arabidopsis thaliana АДФ-глюкозопирофосфорилаза придают гетеротетрамерному ферменту различные кинетические и регуляторные свойства. J Biol Chem 278: 28508–28515

Статья PubMed Google ученый

Crevillén P, Ventriglia T, Pinto F, Orea A, Mérida Á, Romero JM (2005) Дифференциальный паттерн экспрессии и регуляция сахара в генах, кодирующих АДФ-глюкозопирофосфорилазу Arabidopsis thaliana . J Biol Chem 280 (9): 8143–8149

Статья PubMed Google ученый

Данишуддин М., Чатрат Р., Сингх Р. (2011) Анализ взаимодействия малых и больших субъединиц АДФ-глюкозопирофосфорилазы из мягкой пшеницы ( Triticum aestivum L.). Биоинформация 6 (4): 144–148

Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Давар С., Джайн С., Кумар С. (2013) Понимание трехмерной структуры АДФ-глюкозопирофосфорилазы из риса ( Oryza sativa L.). J Mol Модель 19: 3351–3367

CAS Статья PubMed Google ученый

Фирон Н., ЛаБонте Д. , Виллордон А., Кфир Ю., Солис Дж., Ляпис Е., Перлман Т. С., Дорон-Файгенбойм А., Хецрони А., Альтан Л., Надир Л. А. (2013) Транскрипционное профилирование корней сладкого картофеля (Ipomoea batatas) указывает на подавление биосинтеза лигнина и активацию биосинтеза крахмала на ранней стадии формирования запасного корня. BMC Genom 14: 460

CAS Статья Google ученый

Frueauf JB, Ballicora MA, Preiss J (2003) АДФ-глюкозопирофосфорилаза из клубней картофеля: сайт-направленный мутагенез гомологичных остатков аспарагиновой кислоты в малых и больших субъединицах.Завод J 33: 503–511

CAS Статья PubMed Google ученый

Georgelis N, Braun EL, Shaw JR, Hannaha LC (2007) Две субъединицы AGPase развиваются у покрытосеменных с разной скоростью, но они одинаково чувствительны к изменяющим активность аминокислотным изменениям при экспрессии в бактериях. Растительная клетка 19: 1458–1472

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Guo AY, Zhu QH, Chen X, Luo JC (2007) GSDS: сервер отображения генной структуры.И Чуань. 29 (8): 1023–1026

CAS Статья PubMed Google ученый

Hannah LC, Shaw JR, Giroux MJ, Reyss A, Prioul JL, Bae JM, Lee JY (2001) Гены кукурузы, кодирующие малую субъединицу АДФ-глюкозопирофосфорилазы. Физиология растений 127: 173–183

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Harn CH, Bae JM, Lee SS, Min SR, Liu JR (2000) Наличие множественных кДНК, кодирующих изоформу большой субъединицы АДФ-глюкозопирофосфорилазы из сладкого картофеля, и характеристика уровней экспрессии. Физиология растительных клеток 41 (11): 1235–1242

CAS Статья PubMed Google ученый

He X, Zheng T, Su J, Chen Z (2011) Экстракция ДНК 7 видов растений меластомацеи с использованием модифицированного метода CTAB. Чин Дж. Троп Агрич 31 (10): 73–77

CAS Google ученый

Hwang SK, Hamada S, Okita TW (2006) Сайт связывания АТФ в большой субъединице АДФ-глюкозопирофосфорилазы растения.FEBS Lett 580: 6741–6748

CAS Статья PubMed Google ученый

Hwang SK, Nagai Y, Kim D, Okita TW (2008) Прямая оценка большой субъединицы АДФ-глюкозопирофосфорилазы клубней картофеля в функции фермента путем изучения новой мутантной формы. J Biol Chem 283: 6640–6647

CAS Статья PubMed Google ученый

Джеймс М.Г., Дениерц К., Майерс А.М. (2003) Синтез крахмала в эндосперме злаков.Биол растений 6: 215–222

CAS Google ученый

Jin X, Ballicora MA, Preiss J, Geiger JH (2005) Кристаллическая структура АДФ-глюкозопирофосфорилазы клубней картофеля. EMBO J 24: 694–704

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Kim TW, Goo YM, Lee CH, Lee BH, Bae JM, Lee SW (2009) Промотор гена АДФ-глюкозопирофосфорилазы сладкого картофеля ( ibAGP1 ) обеспечивает высокий уровень экспрессии репортерного гена GUS в картофеле. клубень.C R Biol 332: 876–885

CAS Статья PubMed Google ученый

Kwak MS, Oh MJ, Lee SW, Shin JS, Paek KH, Bae JM (2007) Сильная конститутивная система экспрессии генов, полученная из промотора ibAGP1 и его транзитного пептида. Rep клетки растений 26: 1253–1262

CAS Статья PubMed Google ученый

Kwak MS, Oh MJ, Paek KH, Shin JS, Bae JM (2008) Рассеянный эффект транзитного пептида гена АДФ-глюкозопирофосфорилазы из сладкого картофеля ( ibAGP2 ) в увеличении накопления чужеродного белка.Rep клетки растений 27: 1359–1367

CAS Статья PubMed Google ученый

org/ScholarlyArticle»>

Ларкин М.А., Блэкшилдс Г., Браун Н.П., Ченна Р., МакГеттиган П.А., МакВиллиам Х., Валентин Ф., Уоллес И.М., Уилм А., Лопес Р., Томпсон Д.Д., Гибсон Т.Дж., Хиггинс Д.Г. (2007) Clustal W и Clustal X версия 2.0. Биоинформатика 23 (21): 2947–2948

CAS Статья PubMed Google ученый

Lee SK, Hwang SK, Han M, Eom JS, Kang HG, Han Y, Choi SB, Cho MH, Bhoo SH, An G, Hahn TR, Okita TW, Jeon JS (2007) Идентификация ADP- изоформы глюкозопирофосфорилазы, необходимые для синтеза крахмала в эндосперме листьев и семян риса ( Oryza sativa L.). Plant Mol Biol 65: 531–546

CAS Статья PubMed Google ученый

Морелл М.К., Блум М., Ноулз В., Прейсс Дж. (1987) Субъединичная структура АДФ-глюкозопирофосфорилазы листьев шпината. Физиология растений 85: 182–187

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S, Heijne G (1997) Идентификация прокариотических и эукариотических сигнальных пептидов и прогнозирование их сайтов расщепления.Protein Eng 10: 1–6

CAS Статья PubMed Google ученый

Noh SA, Kwak MS, Lee HS, Huh GH, Liu JR, Shin JS, Bae JM (2004) Геномные организации двух малых субъединиц генов АДФ-глюкозопирофосфорилазы из сладкого картофеля. Ген 339: 173–180

CAS Статья PubMed Google ученый

Park SW, Chung WI (1998) Молекулярное клонирование и органоспецифическая экспрессия трех изоформ гена ADP-глюкозопирофосфорилазы томатов. Ген 206: 215–221

CAS Статья PubMed Google ученый

Петрейков М., Эйзенштейн М., Есельсон Ю., Прейсс Дж., Шаффер А.А. (2010) Характеристика изоформ большой субъединицы AGPазы томатов показывает, что рекомбинантная субъединица L3 активна как мономер. Biochem J 428: 201–212

CAS Статья PubMed Google ученый

Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK (2010) edgerR: пакет биопроводников для анализа дифференциальной экспрессии цифровых данных экспрессии генов.Биоинформатика 26 (1): 139–140

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

org/ScholarlyArticle»>

Salamone PR, Greene TW, Kavakli IH, Okita TW (2000) Выделение и характеристика гомотетрамера малой субъединицы АДФ-глюкозопирофосфорилазы высших растений. FEBS Lett 482: 113–118

CAS Статья PubMed Google ученый

Smith-White BJ, Preiss J (1992) Сравнение белков АДФ-глюкозопирофосфорилазы из различных источников.J Mol Evol 34: 449–464

CAS Статья PubMed Google ученый

Тамура К., Дадли Дж., Ней М., Кумар С. (2007) MEGA4: программа молекулярно-эволюционного генетического анализа (MEGA), версия 4.0. Mol Bio Evol 24: 1596–1599

CAS Статья Google ученый

org/ScholarlyArticle»>

Tao X, Gu Y-H, Wang H-Y, Zheng W, Li X, Zhao C-W, Zhang Y-Z (2012) Цифровой анализ экспрессии генов на основе интегрированной сборки транскриптома de novo сладкого картофеля [ Ipomoea batatas (L.) Лам.]. PLoS One 7 (4): e36234

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Ventriglia T, Kuhn ML, Ruiz MT, Ribeiro-Pedro M, Valverde F, Ballicora MA, Preiss J, Romero JM (2008) Две большие субъединицы АДФ-глюкозопирофосфорилазы Arabidopsis ( APL1 и APL1 ) являются каталитическими. Физиология растений 148: 65–76

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Zhang P, Chen C, Shen Y, Ding T, Ma D, Hua Z, Sun D (2013) Осахаривание крахмала и ферментация сырых корней сладкого картофеля для производства топливного этанола. Биоресур Технол 128: 835–838

CAS Статья PubMed Google ученый

Суточные изменения транскриптома, кодирующего ферменты метаболизма крахмала, предоставляют доказательства как транскрипционной, так и посттранскрипционной регуляции метаболизма крахмала в листьях арабидопсиса

Крахмал — основная форма, в которой углерод хранится в растениях, главный источник калорий в организме человека. диета и важный промышленный товар (Jobling, 2004).Однако наше понимание природы и регуляции путей синтеза и деградации крахмала является неполным. Последовательность генома арабидопсиса вместе с обширными ресурсами функциональной геномики облегчает исследования для лучшего понимания метаболизма крахмала в растениях (Zeeman et al., 2002; Smith et al., 2003). Крахмал синтезируется во многих органах Arabidopsis, включая листья, цветы, развивающиеся семена и корневые шляпки, а структура и состав крахмала, выделенного из листьев, аналогичны таковым из культурных растений (Zeeman et al. , 2002). Использование листьев позволяет изучать как синтез, так и разложение в течение 24 часов независимо от изменений в развитии растений. Эти два процесса интегрированы друг с другом, и их скорость зависит от продолжительности дня и ночи. Характерные изменения содержания сахаров и мальтоолигосахаридов также наблюдаются в течение суточного цикла, что свидетельствует о сложной интеграции крахмала и метаболизма сахара. Таким образом, лист арабидопсиса представляет собой превосходную модельную систему, с помощью которой можно выяснить пути и регуляторные механизмы синтеза и распада крахмала в пластидах живых клеток (Zeeman et al., 2002; Смит и др., 2003).

Последовательность генома арабидопсиса выявляет многие гены, кодирующие ферменты, которые могут участвовать в синтезе и разложении крахмала, а также в синтезе Suc из крахмала. Некоторые из этих ферментов были тщательно изучены у других видов, и их функции хорошо известны (например, синтазы крахмала и ферменты ветвления), в то время как функции других неизвестны. Во многих случаях несколько генов Arabidopsis кодируют разные предполагаемые изоформы одного и того же фермента, в некоторых случаях с различной информацией о субклеточном нацеливании.С увеличением доступности функциональных геномных ресурсов арабидопсиса теперь возможен всесторонний анализ функции всех предполагаемых ферментов метаболизма крахмала.

Выделение мутантов с использованием методов прямой и обратной генетики дало важную информацию о некоторых из этих ферментов. Результаты привели к некоторым удивительным открытиям: ферменты, которые ранее считались важными, не имеют очевидной роли, а белки с ранее неизвестной функцией оказались важными.Было обнаружено, что мутант ( dbe1 ), идентифицированный в результате необычного окрашивания крахмала листьев йодом, содержит как крахмал, так и фитогликоген (Zeeman et al., 1998a). Мутация, отвечающая за этот фенотип, происходит в гене, кодирующем фермент, расщепляющий крахмал изоамилазного типа (ISA2 или DBE1). Этот мутант свидетельствует о том, что фермент разветвления необходим для нормального синтеза крахмала у Arabidopsis, как и у других растений (Myers et al. , 2000). Однако точная функция ферментов разветвления в синтезе крахмала все еще не ясна.Было показано, что мутант Arabidopsis ( sex1 ) с пониженной скоростью деградации крахмала (Yu et al., 2001) несет мутацию в гене, кодирующем белок R1, глюкан, водную дикиназу (GWD), необходимый для нормального крахмала. деградация картофеля ( Solanum tuberosum ; Lorberth et al., 1998; Ritte et al., 2002). Этот фермент фосфорилирует амилопектиновый компонент крахмала, но причина, по которой он необходим для нормального разложения крахмала, еще не установлена. Фермент (ы), ответственный за первичную атаку на гранулы крахмала, чтобы инициировать распад, все еще неизвестен.Исследования наших лабораторий показывают, что ни α -амилаза (AMY; H. Dunstan, D. Fulton, and S. Smith, неопубликованные данные), ни фосфорилаза крахмала (Zeeman et al., 2004a) не требуются для разложения крахмала в листьях арабидопсиса. , но, по-видимому, требуется β -амилаза (БАМ) (Д. Фултон, Х. Данстан, С. Зееман и С. Смит, неопубликованные данные). Однако значительный прогресс был достигнут в установлении пути метаболизма продуктов распада крахмала. Было показано, что диспропорционирующий фермент (DPE1) необходим для превращения мальтотриозы в более крупные мальтоолигосахариды, которые могут подвергаться дальнейшей атаке амилолитическими ферментами, и Glc, который экспортируется из пластид (Critchley et al., 2001). Исследования мутанта с высоким содержанием крахмала, который накапливает мальтозу ( mex1 ), привели к открытию, что мальтоза является основным продуктом распада крахмала (что соответствует ключевой роли БАМ). Было обнаружено, что мутировавший ген кодирует новый переносчик, который необходим для экспорта мальтозы из хлоропласта (Niittylä et al., 2004). Непосредственная судьба мальтозы, экспортированной из хлоропласта, была обнаружена нокаут-мутантами, у которых отсутствует цитозольный диспропорционирующий фермент-подобный белок (DPE2).Эти растения накапливают очень высокий уровень мальтозы (Lu and Sharkey, 2004; Chia et al. , 2004). DPE2, как было показано, переносит глюкозильную единицу с мальтозы на гликоген in vitro, подтверждая новый путь углеводного метаболизма в цитозоле листьев Arabidopsis в ночное время (Chia et al., 2004).

Анализ микрочипов показал, что транскрипты по крайней мере для некоторых из этих ферментов демонстрируют сильные суточные изменения (Harmer et al., 2000). Было высказано предположение, что они могут быть важны в регулировании процессов синтеза и разложения.Однако систематических попыток соотнести транскриптом с количествами и активностями ферментов и с потоками через пути синтеза и разложения крахмала в течение 24 часов не предпринималось. Здесь мы представляем результаты для уровней транскриптов в течение цикла день-ночь. Мы используем наши предыдущие данные о количестве и активности ферментов, а также о количестве крахмала и его метаболитов, чтобы выяснить, в какой степени изменения в транскриптоме крахмала отражаются и могут быть связаны с изменениями метаболических потоков в крахмал и из него.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Физиологический контекст анализа транскриптома

Условия, выбранные для исследования транскриптома крахмала в течение суточного цикла, были теми, которые обычно используются при исследованиях метаболизма крахмала в наших лабораториях (например, Zeeman et al., 1998a, 2002; Critchley et al., 2001). Эти исследования предоставляют данные о синтезе, структуре и разложении крахмала, количестве и активности многих ферментов метаболизма крахмала, а также количестве Suc, гексоз, мальтозы и мальтоолигосахаридов в листьях.Таким образом, они обеспечивают отличную основу для интерпретации информации об изменениях в транскриптоме. В условиях, которые мы обычно используем в наших экспериментах — цикл 12 часов света / 12 часов темноты на стадии роста 3.90 (Boyes et al., 2001) — крахмал постепенно разлагается в течение темного периода и постепенно накапливается на протяжении светового периода. период. Эксперименты с импульсной погоней с ¹⁴ CO ₂ показывают, что в световой период не происходит значительного разложения крахмала (Zeeman et al. , 2002). Изменения содержания крахмала, мальтоолигосахаридов, Suc и гексоз в таких растениях показаны на рисунке 1. Все основные суточные тенденции и относительные количества этих метаболитов очень устойчивы и воспроизводимы между партиями растений.

Рис. 1.

Содержание крахмала и сахара в листьях в течение 24-часового суточного цикла. Растения выращивали в условиях, идентичных условиям для растений, собранных для анализа транскриптов. Измерения проводились согласно Critchley et al. (2001). Значения представляют собой средние значения пяти измерений, каждое из которых выполнено на отдельном предприятии.Suc, Черные квадраты; гексозы, белые ромбы; мальтоолигосахариды, черные круги. Значения, превышающие 10% от средних, отображаются в виде столбцов, где они больше символов. Для каждого метаболита одни и те же основные тенденции в значениях в течение 24 часов демонстрировались по крайней мере двумя дополнительными, отдельно выращенными партиями растений.

Экспериментальный дизайн анализа транскриптомов

Мы собирали листья в 11 временных точках, которые мы обычно используем для анализа метаболитов (рис. 1). Сбор урожая особенно сосредоточен на периодах сразу после перехода от темноты к свету и от света к темноте, поскольку изменения в углеводном обмене наиболее выражены в это время. Первый образец был взят в конце светового периода, а последующие образцы были взяты через 1, 2, 4, 8 и 12 часов темноты, затем через 1, 2, 4, 8 и 12 часов света. Таким образом, последний образец является копией первого.

Для каждого образца мы собрали по три листа с каждого из восьми растений, чтобы уменьшить биологическую изменчивость, насколько это возможно.Мы использовали отдельные микроматрицы в каждый момент времени, потому что массивы геномов Affymetrix хорошо воспроизводимы (менее 0,6% генов демонстрируют 2-кратную разницу в экспрессии из-за технической вариабельности; http://nasc.nott.ac.uk/). Доказательства надежности данных были получены путем наблюдения прогрессивных изменений уровней отдельных транскриптов в последовательные моменты времени в суточном цикле и путем наблюдения очень похожих паттернов экспрессии для скоординированно регулируемых генов (см. Ниже). Наконец, повторив весь эксперимент на растениях, выращенных в одной камере для выращивания, мы смогли продемонстрировать воспроизводимость результатов (см. Ниже).

Выбор генов для анализа

Мы сосредоточили наш анализ на генах, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе крахмала из промежуточного продукта цикла Кальвина Fru-6-P, и в превращении крахмала в мальтозу и Glc в темноте (Таблица I). Для синтеза крахмала мы включили гены, кодирующие хлоропластную фосфоглюкоизомеразу (PGI) и фосфоглюкомутазу (PGM), субъединицы ADP-Glc пирофосфорилазы (AGPase), синтазы крахмала (STS) и изоформы фермента ветвления крахмала (SBE), а также изоформы ISA1 и ISA2), гомологичный изоамилазным белкам, которые составляют основную изоамилазную активность клубней картофеля (Hussain et al., 2003). Эти ферменты, как полагают, расположены в хлоропласте, и их гены кодируют предсказанные пластидные транзитные пептиды. Единственным исключением является предсказанный белок, подобный глюкансинтазе (GLS; At5g65685), демонстрирующий примерно 30% идентичность аминокислотной последовательности с синтазами крахмала, который не имеет предсказанной информации о нацеливании.

Таблица I.

Гены, включенные в анализ транскриптома

Путь, по которому крахмал разлагается в листьях ночью, далек от понимания (Smith et al., 2003; Zeeman et al., 2004b), поэтому мы исследовали уровни транскриптов всех ферментов, которые, как было показано, участвуют в этом пути, или предсказаны на основе их последовательностей или известных активностей, способных катализировать соответствующие реакции. Таким образом, мы включаем гены, кодирующие GWD и GWD-подобные ферменты, AMY, BAM, диспропорционирующий фермент (DPE1) и родственный белок DPE2, третью изоамилазу (ISA3), пуллуланазу или предельную декстриназу (LDA), глюкан (крахмал) фосфорилазы ( PHS) и предполагаемых α -глюкозидаз (AGL).Для некоторых из этих ферментов есть убедительные доказательства того, что они встречаются в пластиде, а некоторые кодируются генами, включая предсказанные транзитные пептиды для нацеливания на пластиды (Таблица I). AMY2 и некоторые предполагаемые AGL, по-видимому, синтезируются с предполагаемыми сигнальными последовательностями для нацеливания на эндомембрану. Другие белки не содержат очевидной информации о нацеливании и поэтому считаются цитозольными. Функции этих непластидных ферментов неизвестны, но они потенциально могут участвовать в метаболизме продуктов распада крахмала, экспортируемых из пластид, или в деградации крахмала в лизосомоподобных вакуолях, или в метаболизме внеклеточных глюканов.

Мы также включили гены, кодирующие транспортеры на оболочке хлоропласта, которые способны переносить метаболиты, связанные с метаболизмом крахмала, между хлоропластом и цитозолем, включая недавно открытый транспортер мальтозы (Niittylä et al., 2004). Текущие данные показывают, что мальтоза и Glc являются основными формами, в которых продукты распада крахмала в ночное время экспортируются в цитозоль из хлоропластов (Critchley et al., 2001; Niittylä et al., 2004; Weise et al., 2004). Недавние исследования показывают, что фермент, подобный глюкозилтрансферазе (DPE2), необходим для метаболизма мальтозы вне хлоропласта (Lu and Sharkey, 2004; Chia et al. , 2004), поэтому мы включили это в наш анализ. В общей сложности мы представляем данные об экспрессии 48 генов, хотя мы признаем, что могут быть и другие, которые могут играть потенциальную роль в синтезе или распаде крахмала, например, белок 14-3-3, предположительно взаимодействующий с синтазой крахмала (Sehnke et al. ., 2001) и протеинкиназы и фосфатазы, участвующие в фосфорилировании ферментов синтеза крахмала (Tetlow et al., 2004). Данные микрочипов для всех других генов могут быть получены при необходимости в будущем.

Обзор и проверка результатов

Microarray анализ с использованием массива генома Affymetrix ATh2 был проведен Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC) с использованием доставленной им РНК. Данные микрочипа доступны для общего доступа на веб-сайте NASC (http://nasc.nott.ac.uk/). Чтобы получить обзор тенденций в экспрессии транскриптома в первом эксперименте, гены с низким сигналом экспрессии (произвольно выбранные как 6 или более временных точек со значениями ниже 50) были исключены из общего набора из 22 810 генов, оставив подмножество 9 437 генов. Значения экспрессии для каждого гена в подгруппе были нормализованы к значению в нулевой момент времени (0 ч) и выражены как кратное изменение сигнала в каждый последующий момент времени. Результаты (рис. 2А) показывают несколько поразительных особенностей. Во-первых, изменения в экспрессии генов наиболее выражены сразу после переходов от света к темноте и от темноты к свету. Некоторые гены в этом наборе показывают изменения в экспрессии до 50 раз. Другие, не включенные в этот набор, показывают еще большие изменения в экспрессии генов в течение суточного цикла (данные не показаны).Во-вторых, количество некоторых транскриптов увеличивается до светового периода и после этого продолжает увеличиваться, что позволяет предположить, что они могут находиться под циркадным контролем (Harmer et al., 2000; Schaffer et al., 2001). В-третьих, сигнал для подавляющего большинства транскриптов в 24-часовой временной точке очень похож на сигнал в 0-часовой временной точке, как и ожидалось от репликативных образцов. Было обнаружено, что из 9852 генов с сигналами 50 или более как в 0 ч, так и в 24 ч, только 39 показали более чем 2-кратную разницу в экспрессии между этими образцами.Напротив, между 12 и 13 часами было замечено 444 таких различия, а между 16 и 20 часами — 603 таких различия (данные не показаны). Данные для второго эксперимента показали те же общие особенности (данные не показаны).

Рисунок 2.

Сравнение профилей экспрессии подмножеств генов и генов с известной суточной регуляцией. A, Профиль экспрессии для подмножества из 9437 генов, который исключает те, которые экспрессируются на очень низком уровне (6 или более значений сигнала менее 50). Значения выражения выражены как кратное изменение относительно значений в нулевой момент времени.Два гена, показывающих наибольшее кратное увеличение, оба кодируют белки с неизвестной функцией (At5g54130 и At3g54500), а тот, который демонстрирует наибольшее кратное уменьшение, кодирует предполагаемый Gly-богатый РНК-связывающий белок (At2g21660). Предполагается, что четыре гена, экспрессия которых увеличивается примерно в 4 раза через 24 часа по сравнению с 0 часами, кодируют белок-переносчик липидов (At5g59320), убиквитин-родственную протеазу (At3g28220), вакуолярный запасной белок Vsp1 (At5g24780) и мирозиназу. -связывающий белок (At1g52040). B, экспрессия CCA1 (At2g46830), LHY (At1g01060), TOC1 (At5g61380), ELF3 (At2g25930), CAB05070 (At2g46830), (At2g045070), эксперимент (At2g4000570)C, экспрессия тех же генов, которые показаны на B, в эксперименте 2. D, экспрессия гена TPT (At5g46110) и шести генов, показывающих наиболее сходные профили экспрессии в эксперименте 1. Эти гены кодируют глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (At12900), PSI субъединица X (At1g30380), активаза Рубиско (At2g39730), субъединица VI PSI (At3g16140), Fru-1,6-бисфосфатальдолаза (At4g38970) и белок PSII (At2g06520). E, экспрессия тех же генов, которые показаны на D, в эксперименте 2.

Для очень небольшого числа генов в обоих экспериментах сигнал через 24 часа в несколько раз больше, чем сигнал через 0 часов. Некоторые из этих генов, такие как гены, кодирующие VSP1 (Guerineau et al., 2003) и супероксиддисмутазу (At4g25100), могут быть очень чувствительны к биотическим и абиотическим факторам, что означает, что в процессе сбора листьев растения были каким-то образом стимулировали, хотя были предприняты большие усилия, чтобы свести к минимуму беспокойство растений. Ген RAM1 ( BAM5 ), кодирующий непластидный BAM, является другим геном, экспрессия которого заметно выше в 24-часовой временной точке, чем в 0-часовой (см. Ниже).Однако в целом степень соответствия между значениями в 0 и 24 часа отличная.

Затем мы искали некоторые индикаторы надежности сигналов, производимых каждым массивом генома, и сопоставимости двух экспериментов. Во-первых, мы изучили паттерны экспрессии генов, которые ранее широко изучались в контексте суточной или циркадной регуляции. Для этих целей и для всей последующей оценки профилей экспрессии мы нормализовали данные для каждого гена в процентах относительно среднего уровня его экспрессии в течение суточного цикла (Harmer et al. , 2000). Это позволило избежать нормализации до единичных значений для каждого гена. Гены CCA1 и LHY кодируют факторы транскрипции MYB, которые, как полагают, являются компонентами центрального осциллятора циркадных часов (Hayama and Coupland, 2003). Паттерны экспрессии этих двух генов удивительно похожи друг на друга, как в рамках экспериментов, так и между ними (рис. 2, B и C), и согласуются с опубликованными данными (Wang and Tobin, 1998). Гены TOC1 и ELF3 регулируются часами и демонстрируют сходные паттерны экспрессии, которые хорошо воспроизводятся между экспериментами (рис.2, B и C) и согласуются с опубликованными данными (Strayer et al., 2000; Liu et al., 2001). TOC1 регулирует время экспрессии генов, кодирующих хлорофилл a / b -связывающих белков (CAB). Из 21 генов, родственных CAB- у Arabidopsis, 16 представлены в массиве геномов ATh2, но не конкретно CAB1 и CAB2 , которые были наиболее изучены (Millar and Kay, 1991). Большинство генов CAB имеют сходные профили экспрессии, и два показаны в качестве примеров (рис.2, Б и В). Эти гены имеют сходные паттерны экспрессии в каждом эксперименте, что согласуется с опубликованными данными о суточной регуляции генов CAB , о которых сообщалось ранее (Millar and Kay, 1991).

Чтобы проверить релевантность относительно небольших изменений видимых уровней экспрессии гена между временными точками, мы сначала сосредоточились на гене, кодирующем транспортер триозофосфата (TPT1). Уровень экспрессии этого гена мало меняется по величине, но демонстрирует сложную картину изменений.Программное обеспечение GeneSpring (http://www.silicongenetics.com) использовалось для поиска генов со сходными профилями экспрессии в первом эксперименте. Семь генов с профилями, наиболее похожими на TPT1 (рис. 2D), все кодируют белки хлоропластов, все с функциями фотосинтеза. Один из этих генов кодирует глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, которая продуцирует субстрат для TPT1. Те же семь генов показывают коэкспрессию во втором эксперименте (рис. 2E), хотя картина в деталях отличается от таковой в первом.Небольшие различия между экспериментами указывают на то, что некоторые аспекты физиологии листьев могли быть разными в каждом эксперименте. Однако паттерны экспрессии генов, не связанных напрямую с фотосинтезом, были замечательно согласованы между экспериментами (рис. 2, B и C; см. Ниже). Совпадение последовательных значений для этих родственных генов в течение суточного цикла обеспечивает уверенность в том, что индивидуальные значения для каждого гена являются надежными и что даже относительно небольшие изменения уровня транскрипта в последовательные моменты времени могут иметь значение.К аналогичному выводу пришли Menges et al. (2003) в исследовании с использованием микрочипов ATh2 для анализа прогрессирующих изменений экспрессии генов в культурах клеток.

Сила сигналов транскрипта для 48 исследуемых генов широко варьировала (Таблица I). Индивидуальные значения для некоторых генов были значительно ниже общепринятого порогового значения 100. Следует проявлять осторожность при интерпретации результатов с низким уровнем сигнала. Взаимосвязь между силой сигнала и уровнями мРНК была исследована путем сравнения силы сигнала Affymetrix с количеством мРНК, оцененным с помощью Massively Parallel Sequence Signatures (MPSS; Brenner et al., 2000), в розетке листья через 2 ч после перехода от светлого к темному (http://dbixs001.dbi.udel.edu/MPSS4/java.html). Соответствие между двумя наборами значений в целом было очень хорошим (данные не показаны), что указывает на то, что сигналы Affymetrix для большинства генов обеспечивают хорошую меру содержания мРНК по отношению к общему количеству РНК в образце. В нескольких случаях, когда не было хорошего соответствия, мы сравнивали оба значения с частотами выраженных тегов последовательностей, указанными для каждого гена.Такие соображения привели нас к выводу, что для некоторых генов (например, PHS2 и ISA3 ) сила сигнала Affymetrix, вероятно, переоценивает количество мРНК, тогда как для других (например, BAM9 ) она занижает (данные не показаны). Однако для целей представленного здесь анализа абсолютные количества каждой мРНК обычно менее важны, чем временной паттерн экспрессии.

Экспрессия генов, кодирующих ферменты синтеза крахмала

Результаты экспериментов 1 и 2 были очень похожи для всех генов метаболизма крахмала, поэтому в последующих разделах показаны только те из эксперимента 1, за исключением указанных.Существуют отдельные гены, кодирующие PGI и PGM хлоропластов, ферменты, ответственные за превращение Fru-6-P в Glc-6-P и Glc-1-P для синтеза крахмала. Транскрипты для этих двух ферментов демонстрируют разные суточные паттерны: PGI1 транскрипт изменяется относительно мало, тогда как PGM1 транскрипт уменьшается в темноте и увеличивается на свету (рис. 3A). Всего шесть генов кодируют большие и малые субъединицы AGPase: четыре гена большой субъединицы ( APL ) и два гена малых субъединиц ( APS ).Мутационный анализ показывает, что большая часть активности в листе происходит от генов APS1 и APL1 . Мутации в APS1 приводят к растениям ( adg1, мутанты) без измеримой активности AGPase в листьях и практически без крахмала (Lin et al., 1988a; Wang et al., 1998). Мутации в APL1 приводят к тому, что растения ( adg2 мутантов) лишены 95% активности AGPase и 60% листового крахмала (Lin et al., 1988b; Wang et al., 1997).В соответствии с основной ролью этих двух генов, их уровни транскриптов намного выше, чем у других генов AGPase (Таблица I). Транскрипты для этих двух субъединиц показывают относительно небольшие изменения в суточном цикле (Fig. 3B), хотя у APL1 действительно увеличивается в световой фазе, аналогично таковому у PGI1 . Было показано, что APS2 не кодирует функциональную AGPазу, вероятно, из-за отсутствия ключевых аминокислотных остатков (Crevillén et al., 2003; Hendriks et al., 2003), а его уровень транскрипции очень низкий.

Рисунок 3.

Паттерны экспрессии генов, кодирующих ферменты синтеза крахмала. Все данные взяты из эксперимента 1. Ключ к номенклатуре генов приведен в таблице I. Данные для APL3 и APS2 исключены из-за очень низкой экспрессии (таблица I).

Существует пять генов STS и три гена SBE, представляющих классы, которые сохраняются у высших растений (Ball and Morell, 2003). Мутационный анализ у видов, отличных от Arabidopsis, предполагает, что каждая изоформа играет определенную роль в определении структуры и состава гранулы крахмала во время ее синтеза (например,грамм. Эдвардс и др., 1999; Schwall et al., 2000; Fulton et al., 2002). Уровни транскриптов для этих восьми генов не изменяются согласованным образом в течение 24 часов (рис. 3, C и D). На самом деле нет двух генов, показывающих абсолютно одинаковый паттерн. Транскрипты для гранулярно-связанной крахмальной синтазы (GBS) показывают резкое суточное изменение, намного большее, чем для других ферментов STS и SBE. Это изменение наблюдалось у других видов и, как было показано, находится под контролем циркадных ритмов (Merida et al. , 1999; Wang et al., 1999). GBS отличается от других синтаз крахмала тем, что находится исключительно в матрице гранул крахмала и активен в синтезе амилозного компонента крахмала в этом месте.Мы предполагаем, что глубокие суточные изменения уровней транскриптов могут отражать потребность в ресинтезе белка GBS после деградации гранул в ночное время. Иммуноблот-анализ уровней GBS в нерастворимой (крахмалосодержащей) и растворимой фракциях листа в течение 12-часового светового периода подтверждает эту идею. Белок GBS не обнаруживается ни в какой точке растворимой фракции листа (данные не показаны). В пересчете на свежий вес количество нерастворимой фракции листа очень мало в конце ночи.Оно резко увеличивается в течение первых 4 часов дня (рис. 4A, сравните время 0 и 4 часа). В пересчете на крахмал белок больше всего в конце ночи и падает в течение дня (рис. 4). Взятые вместе с суточным графиком синтеза и разложения крахмала (рис. 1), эти данные предполагают, что GBS разрушается, поскольку он высвобождается из гранул во время разложения в ночное время. В конце ночи количество в листе очень мало. Синтез GBS происходит в течение первой части светового периода, затем замедляется или останавливается, пока продолжается синтез крахмала.Таким образом, белок GBS, по-видимому, более распространен ближе к центру гранулы, чем на периферии, и, следовательно, остаточный крахмал в конце ночи имеет очень высокое содержание GBS. Следовательно, повышение уровня транскрипта GBS во второй половине ночи и в первые 2 часа дня может быть связано с суточным периодом синтеза этого белка.

Рисунок 4.

Суточные изменения количества белков GBS и DPE2. A и B показывают иммуноблоты 7,5% SDS-полиакриламидных гелей. Указаны положения маркеров молекулярной массы (массы в кДа).A. Иммуноблот, разработанный с использованием антисыворотки к GBS (полученной против белка эмбриона гороха, использованного в разведении 1: 500). A, слева, дорожки загружены 40 мкл г крахмала, очищенного из листьев, собранных в указанное время, из растений, выращенных в режиме 12 часов света / 12 часов темноты. A, справа, дорожки загружены нерастворимым в буфере материалом из эквивалента 3 мг свежего веса листа из листьев, собранных в указанное время. B. Иммуноблоттинг, разработанный с использованием пептид-специфической антисыворотки к DPE2 (используется в разведении 1: 3000).Дорожки загружают растворимым экстрактом из эквивалента 15 мг свежего веса листа, из листьев, собранных в указанные сроки после начала светового периода, из растений, выращенных в режиме 12 часов света / 12 часов темноты.

Второй ген синтазы крахмала STS2 , представляющий класс SSII, также показывает заметное дневное изменение уровня транскрипта. Хотя эта изоформа, вероятно, активна в синтезе амилопектина на внешнем крае гранулы, в некоторых органах растений она, как известно, погружается в гранулы крахмала по мере того, как происходит синтез крахмала (например,грамм. Denyer et al., 1993). Возможно, что суточное поведение транскрипта и белка этой изоформы такое же, как и для GBS, предложенного выше.

Уровни транскриптов для SBE1 и SBE2 показывают небольшие изменения в начале и в конце ночи, но SBE3 показывает характерную картину снижения в течение ночи и быстрого увеличения после 4 часов в светлый период (Рис. . 3D). Мы наблюдали образец, очень похожий на образец SBE3 для нескольких ферментов, предположительно играющих роль в деградации крахмала (см. Ниже).Уровни транскрипта для обеих изоамилаз, участвующих в синтезе крахмала (ISA1 и ISA2), обычно выше днем, чем ночью, и их суточные изменения имеют некоторые сходные особенности (рис. 5А). Паттерн для третьего гена изоамилазы, ISA3 , близко соответствует паттерну, показанному несколькими генами, кодирующими ферменты, предположительно участвующие в деградации крахмала (см. Ниже).

Рисунок 5.

Паттерны экспрессии генов, кодирующих ферменты, потенциально участвующие в расщеплении крахмала.Все данные взяты из эксперимента 1. Ключ к номенклатуре генов приведен в таблице I. Данные для AGL3 исключены из-за очень низкой экспрессии (таблица I).

Коэкспрессированный набор генов, кодирующих предполагаемые ферменты деградации крахмала

Транскрипты, кодирующие ферменты, потенциально участвующие в расщеплении крахмала, демонстрируют широкий спектр профилей экспрессии (рис. 5). Из этого диапазона возникает характерный паттерн, показанный девятью генами: медленное снижение в течение ночи до низкого уровня в течение первых нескольких часов света, за которым следует быстрое увеличение между 4 и 8 часами света (рис.6). Этот отличительный паттерн экспрессии очень согласуется между двумя экспериментами (Рис. 6, A и B) и наводит на мысль о координированной регуляции. Этот набор включает гены, кодирующие три фермента, которые, как было показано, необходимы для нормальной скорости разложения крахмала, а именно GWD1 (Yu et al., 2001), DPE1 (Critchley et al., 2001) и DPE2 (Lu and Sharkey, 2004; Chia et al. др., 2004). Он также включает другие ферменты, которые, как можно разумно ожидать, участвуют в разложении крахмала. К ним относятся AMY3, фосфорилаза пластидного крахмала (PHS1), фермент разветвления (ISA3) и GWD2, который по последовательности тесно связан с GWD1.Тем не менее, PHS1 и AMY3, по-видимому, до сих пор являются незаменимыми для разложения крахмала (Zeeman et al., 2004a; H. Dunstan, D. Fulton и S. Smith, неопубликованные данные), а функции ISA3 и GWD2 еще не изучены. сообщил. Другой фермент в этой группе — цитозольная глюканфосфорилаза (PHS2). Возможная роль цитозольной глюканфосфорилазы в превращении крахмала в Suc предполагает открытие, что DPE2 переносит глюкозильный фрагмент с мальтозы на неизвестный цитозольный акцептор, который, вероятно, является глюканом (Chia et al., 2004). Фермент PHS2 может преобразовывать глюкозильные фрагменты акцептора глюкана в Glc-1-P, который затем становится доступным для синтеза Suc. Тот факт, что профиль экспрессии цитозольной фосфорилазы крахмала такой же, как у DPE2 и других ферментов, которые, как известно, участвуют в деградации крахмала, подтверждает эту гипотезу. Девятый член этой группы, SBE3, является более неожиданным, поскольку считается, что ферменты ветвления участвуют в синтезе крахмала. По крайней мере, для некоторых транскриптов, демонстрирующих этот характерный суточный паттерн, количества белков, которые они кодируют, не изменяются последовательно или существенно в течение суточного цикла.При тех же условиях роста, которые использовались для анализа транскриптов, иммуноблоттинг не выявил заметных различий в количестве GWD1 (Yu et al., 2001) или AMY3 (J.-C. Chen, неопубликованные данные). Аналогично, DPE2 не изменяется в количестве (рис. 4B). Таким образом, количество этих белков регулируется посттранскрипционно.

Рисунок 6.

Коэкспрессия генов метаболизма крахмала плюс четыре гена, кодирующие белки неизвестной функции. Данные взяты из эксперимента 1 (A и C) и эксперимента 2 (B и D).Ключ к номенклатуре генов дан в таблице I, за исключением четырех генов с неизвестной функцией.

Гены, кодирующие другие ферменты, предположительно участвующие в деградации крахмала

Уровни транскриптов AMY1 и 2, GWD3, фермента разветвления LDA1 и AGL не соответствуют скоординированному паттерну, описанному выше (фиг. 5 и 6). Каждый показывает отчетливую картину изменений в течение 24 часов. Уровни транскрипции AMY2 показывают особенно сильные суточные изменения.Наблюдается заметный рост в конце ночи и падение в первые несколько часов дня. Функции этих ферментов пока не известны. Предполагается, что LDA1 и GWD3 являются пластидными, но другие не имеют очевидных транзитных пептидов пластид. Нокаут-мутанты AMY2 и 3 и LDA1 не нарушают расщепление крахмала в листьях при выращивании в условиях, используемых здесь (Х. Данстан, Д. Фултон, С. Зееман и С. Смит, неопубликованные данные). Нет очевидной потребности в α -глюкозидаз (мальтазы) для превращения крахмала в Suc.Массовое накопление мальтозы в мутантах mex1 и dpe2 (Chia et al., 2004; Niittylä et al., 2004) предполагает, что мальтоза, продуцируемая с помощью БАМ в хлоропласте, экспортируется и затем метаболизируется в цитозоле посредством реакции глюкозилтрансферазы. . Ни один из девяти генов BAM не имеет согласованного суточного паттерна экспрессии, описанного выше (рис. 5). Каждый из четырех BAM, предположительно являющихся пластидными, показывает различный характер суточных изменений уровней транскриптов (фиг. 5C).Наш предварительный анализ нокаут-мутантов показывает, что BAM4 необходим для нормальной скорости разложения крахмала (Д. Фултон, Х. Данстан, С. Зееман и С. Смит, неопубликованные данные), но роль других BAM еще предстоит выяснить. исследованы. Удивительно, но сигнал транскрипта для BAM4 очень низкий (таблица I), и данные MPSS подтверждают, что этот ген слабо экспрессируется в листьях. Среди изоформ, предположительно экстрапластидных, одна изоформа (BAM9) показывает массивное суточное изменение уровня транскрипта, как сообщалось ранее (Chandler et al., 2001). Эта модель похожа на модель AMY2, с резким увеличением в конце ночи и падением в первые несколько часов дня. BAM5 отвечает за большую часть активности BAM листа Arabidopsis и, как полагают, находится во флоэме (Wang et al., 1995). Мутации, устраняющие этот белок (в локусе RAM1 ), не оказывают очевидного влияния на рост и метаболизм растений, и функция этого фермента еще предстоит выяснить (Laby et al. , 2001). В экспериментах 1 и 2, соответственно, уровень транскрипта BAM5 через 24 часа в 5 и 2 раза выше, чем через 0 часов.Это может отражать нарушения растений во время сбора листьев и чувствительность этого гена к экологическим или метаболическим изменениям (Caspar et al., 1989; Laby et al., 2001).

Уровни транскриптов для транспортеров TPT1, GLT1 и MEX1 демонстрируют сложные и разные паттерны суточных изменений с относительно низкой амплитудой (рис. 5H). Наша недавняя работа показывает, что большая часть углерода, полученного из крахмала, экспортируется транспортером мальтозы MEX1 с меньшим вкладом от GLT1 (Niittylä et al., 2004). Паттерн экспрессии этих генов не похож на скоординированный паттерн для девяти разлагающих крахмал ферментов, описанных выше, или паттерны для любого из BAM, которые генерируют мальтозу в хлоропласте.

Путь, с помощью которого мальтоза, экспортированная из хлоропласта, превращается в Suc в цитозоле, полностью не изучен (Chia et al. , 2004). Однако весьма вероятно, что синтез Suc в ночное время, по крайней мере частично, будет включать те же ферменты, что и те, которые активны в этом процессе в течение дня.Соответственно, мы исследовали транскрипты на наличие цитозольных ферментов, необходимых для преобразования Glc в Suc (гексокиназа, цитозольный PGI и PGM, UDP-Glc пирофосфорилаза, Suc-фосфат-синтаза и Suc-фосфат-фосфатаза). Они показывают сложные закономерности изменений суточного цикла. Хотя некоторые из этих транскриптов показывают аналогичные изменения друг в друге, ни один из них не демонстрирует структуру, аналогичную таковой для транскриптов, составляющих транскриптом крахмала (данные не показаны).

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ суточных изменений транскриптома крахмала показывает, что он очень сложен.По большей части, транскрипты, кодирующие ферменты, которые, как считается, функционируют одним и тем же путем, не демонстрируют сходных паттернов изменений в течение 24 часов. Например, мутационный и трансгенный анализ у нескольких видов показывает, что структура крахмала определяется скоординированным действием множества изоформ синтазы крахмала и фермента ветвления крахмала (Schwall et al., 2000; Fulton et al., 2002; Jobling et al. , 2002). Несмотря на это, никакие две изоформы этих ферментов не показывают одинаковый суточный характер изменения транскрипта.Изменения в количестве транскриптов также не скоординированы для двух основных субъединиц AGPase, экспрессируемых в листе, или для хлоропластных BAM, диспропорционирующего фермента (DPE1) и переносчиков мальтозы и Glc (MEX1 и GLT1, соответственно), которые вместе составляют пути деградации глюкана и экспорта в цитозоль ночью (Chia et al., 2004; Niittylä et al., 2004).

Мы идентифицировали набор из девяти генов, которые, по-видимому, экспрессируются координированно. Количество транскриптов уменьшается в темноте и обычно быстро увеличивается между 4 и 8 часами на свету.Транскрипты для восьми из этих генов кодируют ферменты, которые, как известно, необходимы для расщепления крахмала, или, как можно разумно ожидать, это необходимо. Однако они не составляют полный путь (например, БАМ не включены), и они включают белки, очевидно не необходимые для разложения крахмала (PHS1 и AMY3; Zeeman et al., 2004a; H. Dunstan, D. Fulton, и С. Смит, неопубликованные данные). Тем не менее, появление этого набора может отражать взаимодействия между всеми этими ферментами на каком-то уровне, и его открытие побуждает к более детальному изучению функций всех ферментов в этой группе in vivo.

Это несоответствие между РНК и белком для трех членов скоординированно экспрессируемой группы (AMY3, GWD1 и DPE2) указывает на важность посттранскрипционного контроля в регулировании количества ферментов метаболизма крахмала и потоков через ключевые пути. Контроль количества белка может осуществляться как на уровне трансляции, так и на уровне стабильности белка. Возможно, например, что изменения уровня транскрипта для скоординированного набора ферментов отражают существенный оборот этих белков на дневной основе.Одновременное возникновение трансляции и деградации белка в течение определенного ограниченного периода дня позволит поддерживать уровень белка на постоянном уровне в течение дня. Контроль потока через пути синтеза и разложения крахмала, вероятно, будет осуществляться в первую очередь за счет модуляции активности ферментов. Мало что известно о контроле деградации крахмала, но считается, что синтез контролируется в первую очередь посредством модуляции активности AGPase посредством метаболитов и посредством окислительно-восстановительных изменений в структуре ферментов (Neuhaus and Stitt, 1990; Hendriks et al., 2003).

Исключением из этого изображения является GBS1 (и, возможно, STS2). Из-за расположения этого белка внутри гранулы крахмала и потребности в матрице гранул для его активности и стабильности (Denyer et al., 1999; Edwards et al., 1999; Tatge et al., 1999) белок теряется. в темный период по мере разложения крахмала. Он повторно синтезируется в течение первой части светового периода, когда уровни транскрипции максимальны.

Хотя нет очевидного соответствия между уровнями транскриптов, уровнями кодируемых белков и потоками в метаболизме крахмала, информация, полученная об отдельных транскриптах, тем не менее может помочь направить будущие эксперименты для выявления функций кодируемых белков. Например, изоамилаза ISA3 экспрессируется координированно с генами, кодирующими деградирующие ферменты, тогда как ISA1 и ISA2 , которые, как было показано, необходимы для синтеза крахмала, показывают другую картину. Таким образом, ISA3 заслуживает исследования как разветвляющий фермент, участвующий в деградации крахмала в хлоропласте. Изменения уровней транскрипта BAM9 поразительно сходны с изменениями AMY2. Оба фермента являются экстрапластидными; возможно, оба участвуют в деградации одного и того же, еще неизвестного глюкана.

Потенциальное использование скоординированно экспрессируемого набора генов заключается в поиске других генов, демонстрирующих подобный паттерн экспрессии. Это может помочь идентифицировать новые белки, участвующие в метаболизме крахмала. Мы искали весь транскриптом на предмет транскриптов, демонстрирующих тот же самый паттерн экспрессии, выраженный на заметном уровне и кодирующих белки с предполагаемыми транзитными пептидами пластид. Этот поиск выявил небольшое количество генов, кодирующих белки с неизвестной функцией. Паттерны экспрессии четырех из этих генов показаны для экспериментов 1 и 2 (рис.6, В и Г). Транскрипты для этих генов показывают небольшое увеличение уровня между 1 и 2 часами в эксперименте 2, но не в эксперименте 1 (рис. 6, C и D). Транскрипты AMY 3 и PHS1 показывают аналогичное повышение уровня в эксперименте 2, но не в эксперименте 1 (фиг. 6, A и B). Такие тонкие различия в уровне экспрессии, наблюдаемые между разными экспериментами, могут быть особенно полезны при идентификации коэкспрессируемых генов. Возможность того, что эти белки с неизвестной функцией участвуют в деградации крахмала, изучается.

Совместная экспрессия девяти генов метаболизма крахмала предполагает, что они могут регулироваться совместно. Промоторные последовательности этих генов варьируются от 550 до 4680 п.н. (определяемые как межгенные области выше стартового кодона трансляции ATG). Поиски ранее идентифицированных предполагаемых цис-действующих регуляторных элементов с использованием таких программ, как PLACE (Higo et al. , 1999), выявили несколько таких элементов размером 4 или 5 п.н. во всех девяти промоторах, включая ядерные последовательности GATA и I-бокса, обнаруженные на свету. -регулируемые гены (Terzaghi and Cashmore, 1995).Однако такие элементы были также обнаружены в промоторах других генов с совершенно другими профилями транскриптов (данные не показаны). Поиск новых мотивов во всех девяти промоторах с использованием ряда программ (Rombauts et al., 2003) не позволил найти какие-либо консервативные мотивы размером более 5 п.н. Сходным образом при сравнении 3′-нетранслируемых областей всех девяти генов не удалось найти консервативные мотивы. Будущий анализ последовательностей, которые могут регулировать экспрессию этого набора генов, потребует экспериментальных манипуляций с последовательностями ДНК.

Таким образом, очевидно, что отношения между уровнями транскриптов, уровнями белка, ферментативной активностью и потоками углерода в крахмал и из него чрезвычайно сложны. Тем не менее, анализ транскриптома крахмала может дать ключ к разгадке возможной роли отдельных белков и может помочь идентифицировать новые белки, участвующие в синтезе и распаде крахмала. Анализ изменений транскриптома в других ситуациях, например, в ответ на сахарную подкормку гетеротрофных тканей или во время развития семян, может дать еще большее понимание транскриптома крахмала и регуляции синтеза и распада крахмала.Наши результаты уже определили новые цели для изучения и новые гипотезы для проверки.

Журналы, авторы, подписчики, издатели, оповещение

		Наши журналы
		Как крупный международный издатель академических и исследовательских журналов Science Alert издает и разрабатывает названия в сотрудничестве с самыми престижные научные общества и издатели. Наша цель заключается в том, чтобы максимально широко использовать качественные исследования. аудитория.
		Авторам
		Мы прилагаем все усилия, чтобы поддержать исследователей которые публикуют в наших журналах. Есть масса информации здесь, чтобы помочь вам публиковаться вместе с нами, а также ценные услуги для авторов, которые уже публиковались у нас.
		Для подписчиков
		2021 цены уже доступны.Ты может получить личную / институциональную подписку перечисленных журналы прямо из Science Alert. В качестве альтернативы вы возможно, пожелает связаться с выбранным вами агентством по подписке. Направляйте заказы, платежи и запросы в службу поддержки. в службу поддержки клиентов журнала в Science Alert.
		Для обществ
		Science Alert гордится своей тесные и прозрачные отношения с обществом. В качестве некоммерческий издатель, мы стремимся к самому широкому возможное распространение публикуемых нами материалов и на предоставление услуг высочайшего качества нашим издательские партнеры.
		Справочный центр
		Здесь вы найдете ответы на наиболее часто задаваемые вопросы (FAQ), которые мы получили по электронной почте или через контактную форму в Интернете.В зависимости от характера вопросов мы разделили часто задаваемые вопросы на различные категории.
		База данных ASCI
		Азиатский индекс научного цитирования (ASCI) стремится предоставить авторитетный, надежный и значимая информация по освещению наиболее важных и влиятельные журналы для удовлетворения потребностей мировых научное сообщество. База данных ASCI также предоставляет ссылку к полнотекстовым статьям до более чем 25000 записей с ссылка на цитированные ссылки.

ИЗДАТЕЛЬСТВО CSIRO | Земледелие и пастбище

Список литературы

Беттс М.Дж., Рассел Р.Б. (2003) Аминокислотные свойства и последствия замен. В «Биоинформатике для генетиков».Gray, I.C. ’(Eds IC Gray, MR Barnes) (издательство Wiley Publishing: Хобокен, Нью-Джерси, США). http://dx.doi.org/10.1002/0470867302.ch24 Chhabra R, Hossain F, Muthusamy V, Baveja A, Mehta B, Zunjare RU (2019 ) Картирование и проверка эффективности гена пигментации Anthocyanin1 для раннего отбора гена shrunken2 , определяющего сладость ядра кукурузы. Journal of Cereal Science 89 , 258–265.
| Картирование и проверка гена пигментации Anthocyanin1 на предмет его эффективности при раннем отборе гена shrunken2 , определяющего сладость зерна кукурузы. Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | Coulombe-Huntington J, Lam KC, Dias C, Majewski J (2009 ) Мелкомасштабные вариации и генетические детерминанты альтернативного сплайсинга у разных людей. PLOS Genetics 5 , e1000766
| Мелкомасштабные вариации и генетические детерминанты альтернативного сплайсинга у разных людей.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 20011102PubMed | Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB (1985) Минипрепарат ДНК кукурузы. В «Молекулярной биологии растений».(Редакторы Дж. Мальберга, Мессинг, штат Сассекс) стр. 363. (Лаборатория Колд-Спринг-Харбор: Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк, США) Dinges JR, Colleoni C, Myers AM, James MG (2001 ) Молекулярная структура трех мутаций в локусе maizesugary1 и их аллель-специфические фенотипические эффекты. Физиология растений 125 , 1406–1418.
| Молекулярная структура трех мутаций в локусе maizesugary1 и их аллель-специфические фенотипические эффекты.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 11244120PubMed | FAOSTAT (2017) ФАО, Рим. Доступно на: www.faostat.org (по состоянию на 22 октября 2019 г.). Feng ZL, Liu J, Fu FL, Li WC (2008 ) Молекулярный механизм сладкого и воскового в кукурузе. Международный журнал селекции и генетики растений 2 , 93–100.
| Молекулярный механизм сладкого и воскового вкуса кукурузы.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | Flint-Garcia SA, Thornsberry JM, Buckler ES (2003 ) Структура неравновесия по сцеплению у растений. Ежегодный обзор биологии растений 54 , 357–374.
| Структура неравновесия по сцеплению у растений. GoogleScholarGoogle Scholar | 14502995PubMed | Gaudet M, Fara AG, Beritognolo I, Sabatti M (2009 ) Аллель-специфическая ПЦР в генотипировании SNP. Методы молекулярной биологии 578 , 415–424.
| Аллель-специфическая ПЦР в генотипировании SNP.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 19768609PubMed | Greenblatt J (1991 ) Роль TFIID в инициации транскрипции с помощью РНК-полимеразы II. Ячейка 66 , 1067–1070.
| Роль TFIID в инициации транскрипции РНК-полимеразой II.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 12PubMed | Gupta HS, Vignesh M, Hossain F, Nepolean T (2013) Повышение питательных качеств кукурузы посредством селекции с помощью маркеров. В «Национальном семинаре по геномике для улучшения сельскохозяйственных культур». IBAB, Бангалор. (Под ред. П. К. Гупты) стр. 69–70. Hannah LC, Futch B, Bing J, Shaw JR, Boehlein S, Stewart JD, Beiriger R, Georgelis N, Greene T. (2012 ) A shrunken — 2 Трансген увеличивает урожай кукурузы, воздействуя на материнские ткани для увеличения частота развития семян. Растительная клетка 24 , 2352–2363.
| Трансген shrunken — 2 увеличивает урожай кукурузы, воздействуя на материнские ткани, увеличивая частоту развития семян.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 22751213PubMed | Hossain F, Nepolean T, Vishwakarma AK, Panday N, Prasanna BM, Gupta HS (2013 ) Картирование и проверка микросателлитных маркеров, связанных с генами sugary1 и shrunken2 кукурузы. Журнал биохимии растений и биотехнологии.
| Картирование и проверка микросателлитных маркеров, связанных с генами sugary1 и shrunken2 кукурузы.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | Hossain F, Muthusamy V, Pandey N, Vishwakarma AK, Baveja A, Zunjare R, Thirunavukkarasu N, Saha S, Manjaiah KM, Prasanna BM, Gupta HS (2018 ) Маркер-ассистированная интрогрессия opaque2 аллеля для быстрого преобразования аллеля elite гибриды в качественную белковую кукурузу. Журнал генетики 97 , 287–298.
| Маркерная интрогрессия аллеля opaque2 для быстрого превращения элитных гибридов в качественный протеин кукурузы.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 29666347PubMed | Джеймс М.Г., Робертсон Д.С., Майерс А.М. (1995 ) Характеристика гена кукурузы Sugary1 , определяющего состав крахмала в зернах. Растительная клетка 7 , 417–429. Лертрат К., Пулам Т. (2007 ) Селекция для увеличения сладости сладкой кукурузы. Международный журнал селекции растений 1 , 27–30. Liu J, Huang S, Sun M (2012 ) Улучшенный метод конструирования аллель-специфичных праймеров ПЦР для анализа маркеров SNP и его применение. Заводские методы 8 , 34
| Усовершенствованный метод конструирования аллель-специфических праймеров ПЦР для анализа маркеров SNP и его применение.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 22920499PubMed | Mehta B, Hossain F, Muthusamy V, Baveja A, Zunjare R, Jha SK, Gupta HS (2017 ) Анализ генетического разнообразия на основе микросателлитов сахарных1 -, shrunken2 — и двойных мутантных инбредов сладкой кукурузы для их использования в программе разведения. Физиология и молекулярная биология растений 23 , 411–420.
| Микросателлитный анализ генетического разнообразия инбредов сахарных1 -, shrunken2 — и двойных мутантов сладкой кукурузы для их использования в селекционной программе.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 28461728PubMed | Muthusamy V, Hossain F, Nepolean T, Choudhary M, Saha S, Bhat JS, Prasanna BM, Gupta HS (2014 ) Разработка богатых β-каротином гибридов кукурузы посредством интрогрессии с помощью маркеров аллеля β-каротингидроксилазы . PLoS One 9 , e0122130
| Создание гибридов кукурузы, богатых β-каротином, посредством интрогрессии с помощью маркеров аллеля β-каротингидроксилазы .Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 25486271PubMed | Neuffer MG, Coe EH, Wessler SR (1997) «Мутанты кукурузы». (Лаборатория издательства Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor, NY, США) Сагай-Маруф М.А., Солиман К.М., Йоргенсон Р., Аллард Р.В. (1984 ) Полиморфизмы длины пространства рибосомной ДНК в ячмене: менделевское наследование, хромосомные положения и популяционная динамика. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 81 , 8014–8018.
| Полиморфизмы пространственной длины рибосомной ДНК ячменя: менделевское наследование, хромосомные положения и популяционная динамика.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 6096873PubMed | Sarika K, Hossain F, Muthusamy V, Zunjare RU, Baveja A, Goswami R, Bhat JS, Saha S, Gupta HS (2018 ) Маркерное пирамидирование непрозрачных2 и новых непрозрачных16 генов для дальнейшего обогащения лизина и триптофан в субтропической кукурузе. Наука о растениях 272 , 142–152.
| Маркерное пирамидирование генов opaque2 и новых opaque16 для дальнейшего обогащения лизина и триптофана в субтропической кукурузе.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 29807585PubMed | Шен Р., Фан Дж. Б., Кэмпбелл Д., Чанг В., Чен Дж., Дусет Д., Йикли Дж., Бибикова М., Викхэм Дж. Э., Макбрайд С., Стимерс Ф., Гарсия Ф., Кермани Б. Г., Гандерсон К., Олифант А. (2005 ) Высокий- высокопроизводительное генотипирование SNP на универсальных наборах гранул. Исследование мутаций 573 , 70–82.
| Высокопроизводительное генотипирование SNP на универсальных наборах шариков.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 15829238PubMed | Шин Дж. Х., Квон С. Дж., Ли Дж. К., Мин Х. К., Ким Н. С. (2006 ) Генетическое разнообразие генов синтеза крахмала в зерне кукурузы с SNAP. Геном 49 , 1287–1296.
| Генетическое разнообразие генов синтеза крахмала в зернах кукурузы с помощью SNAPs. Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 17213911PubMed | Тиль Т., Кота Р., Гроссе И., Стейн Н., Гранер А. (2004 ) SNP2CAPS: инструмент анализа SNP и INDEL для разработки маркеров CAPS. Исследования нуклеиновых кислот 32 , e5
| SNP2CAPS: инструмент анализа SNP и INDEL для разработки маркеров CAPS.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 14704362PubMed | Tracy WF, Whitt SR, Buckler ES (2006 ) Повторяющиеся мутации и эволюция генома: пример Sugary1 и происхождение сладкой кукурузы. Crop Science 46 , S49 – S54.
| Повторяющиеся мутации и эволюция генома: пример Sugary1 и происхождение сладкой кукурузы.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | Wilson LM, Whitt SR, Ibáñez AM, Rocheford TR, Goodman MM, Buckler ES (2004 ) Рассечение состава ядра кукурузы и производство крахмала по ассоциации генов-кандидатов. Растительная клетка 16 , 2719–2733.
| Вскрытие состава ядра кукурузы и продукции крахмала по ассоциации генов-кандидатов. GoogleScholarGoogle Scholar | 15377761PubMed | Wu JY, Maniatis T (1993 ) Специфические взаимодействия между белками, участвующими в выборе сайта сплайсинга, и регулируемым альтернативным сплайсингом. Ячейка 75 , 1061–1070.
| Специфические взаимодействия между белками, участвующими в выборе сайта сплайсинга, и регулируемым альтернативным сплайсингом.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 8261509PubMed | Wu Y, Zhang Y, Zhang J (2005 ) Распределение элементов энхансера экзонного сплайсинга в генах человека. Genomics 86 , 329–336.
| Распределение элементов энхансера экзонного сплайсинга в генах человека.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 16005179PubMed | Захлер AM, Lane WS, Stolk JA, Roth MB (1992 ) SR-белки: консервативное семейство факторов сплайсинга пре-мРНК. Гены и развитие 6 , 837–847.
| Белки SR: консервативное семейство факторов сплайсинга пре-мРНК.Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | Zunjare RU, Hossain F, Muthusamy M, Baveja A, Chauhan HS, Bhat JS, Saha S, Gupta HS (2018 ) Выработка гибридов кукурузы, богатых множеством питательных веществ, путем складывания с помощью маркеров opaque2 (o2), β-каротина гены гидроксилазы (crtRB1) и ликопен-ϵ-циклазы (lcyE) . Frontiers in Plant Science.
| Создание гибридов кукурузы, богатых множеством питательных веществ, путем складывания с помощью маркеров генов opaque2 (o2), β-каротингидроксилазы (crtRB1) и ликопен-ϵ-циклазы (lcyE) .Crossref | GoogleScholarGoogle Scholar | 29515602PubMed |

Динамика накопления стеблевого крахмала у Sorghum bicolor (Журнальная статья)

МакКинли, Брайан А., Касто, Анна Л., Руни, Уильям Л. и Маллет, Джон Э. Динамика развития накопления стеблевого крахмала у Sorghum bicolor . США: Н. П., 2018. Интернет. DOI: 10.1002 / pld3.74.

Мак-Кинли, Брайан А., Касто, Анна Л., Руни, Уильям Л. и Маллет, Джон Э. Динамика развития накопления стеблевого крахмала у Sorghum bicolor . Соединенные Штаты. https://doi.org/10.1002/pld3.74

МакКинли, Брайан А., Касто, Анна Л., Руни, Уильям Л., и Маллет, Джон Э. Мон. «Динамика развития накопления стеблевого крахмала у Sorghum bicolor». Соединенные Штаты. https://doi.org/10.1002/pld3.74. https://www.osti.gov/servlets/purl/1506456.

@article {osti_1506456,
title = {Динамика развития накопления стеблевого крахмала у Sorghum bicolor},
author = {МакКинли, Брайан А.и Касто, Анна Л. и Руни, Уильям Л. и Маллет, Джон Э.},
abstractNote = {Было выявлено, что сладкое сорго накапливает до ~ 9% от общей сухой массы стебля в виде крахмала. Крахмал накапливался преимущественно в паренхиме сердцевины стебля в непосредственной близости от сосудистых пучков. Стеблевой крахмал накапливался медленно между зарождением цветков и цветением и более быстро между цветением и 43 днями после цветения, прежде чем снижаться параллельно с отрастанием побегов. Гены, участвующие в метаболизме стеблевого крахмала, были идентифицированы с помощью филогенетических подходов и анализа РНК-секвенции экспрессии стеблевого гена Della во время фазы накопления крахмала в развитии.Были идентифицированы гены, дифференциально экспрессируемые в стеблях, которые участвуют в биосинтезе крахмала (например, AGPase SS / LS, синтазы крахмала, ферменты разветвления крахмала), деградации (например, глюкан-водная дикиназа, β-амилаза, диспропорционирующий фермент, альфа-глюканфосфорилаза ) и транспорта амилопластов сахара (транслокатор глюкозы-6-P). Транскрипты, кодирующие субъединицы AGPase SS и LS с пластидной локализацией, дифференцированно индуцировались во время накопления стволового крахмала, что указывает на то, что АДФ-глюкоза для биосинтеза крахмала в первую очередь генерируется в стволовых пластидах.Цитозольный метаболизм гетероглюкана может играть роль в накоплении стебля сахарозы / крахмала, потому что гены, кодирующие цитозольные формы диспропорционирующего фермента и альфа-глюканфосфорилазы, индуцировались параллельно с накоплением стебля сахарозы / крахмала. Информация о пути стеблевого крахмала, полученная в этом исследовании, будет полезна для конструирования стеблей сорго с повышенным содержанием крахмала, тем самым улучшая качество кормов и эффективность преобразования биомассы в биотопливо и биопродукты.